胡蘿卜sⅡ基因啟動子功能區(qū)分析.pdf

1、胡蘿卜可生食，耐儲藏，產量高，易種植，而且是重要的嬰幼兒早期食品，同時轉基因胡蘿卜對環(huán)境具有更高的安全性等優(yōu)點，因此可以作為優(yōu)良的生產口服疫苗的植物載體，但是適合在胡蘿卜中，尤其是在胡蘿卜直根中特異表達外源蛋白的啟動子元件并不成熟。目前用于構建植物表達載體的啟動子主要是組成型啟動子(如花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動子)，相對于組織特異性啟動子，它易造成植物營養(yǎng)浪費。因此我們選擇了胡蘿卜直根特異表達的液泡轉化酶Ⅱ型同工酶(sⅡ)基因的

2、啟動子，并希望利用該啟動子建立一個了胡蘿卜直根特異性高效表達體系。 本實驗首先根據已發(fā)表的s Ⅱ基因的啟動子序列，利用PCR方法擴增得到全長啟動子片段S1，并與GUS報告基因構建了植物表達載體pS1，通過農桿菌LBA4404真空滲透轉化胡蘿卜不同發(fā)育時期(播種后的第3，6，9，12，15，20周)的不同組織(葉片，葉柄，直根)中，3-4天后，檢測報告基因GUS的瞬間表達。同時以含有CaMV 35S啟動子為陽性對照；以缺失CaMV

3、 35S啟動子的N為陰性對照。GUS組織化學染色結果表明，陽性對照35S在不同發(fā)育時期，不同組織的胡蘿卜材料上均有不同程度的GUS著色；陰性對照N在三種組織中均未檢測到GUS著色；啟動子S1只在15周的葉柄組織和直根組織中檢測到GUS著色，且在直根的形成層及木質部著色程度較深，在周皮，韌皮部著色程度較淺。在熒光活性檢測結果表明，陰性對照N在胡蘿卜不同發(fā)育時期不同組織不表達GUS活性，而陽性對照35S則在不同發(fā)育時期的胡蘿卜葉片，葉柄及直

4、根組織都表達了較高的GUS活性。S1則表現出在9-15周的胡蘿卜直根表達較高的GUS活性，而且GUS活性值與35S相當；在其它發(fā)育時期及其它組織中有較低的GUS活性值，結果證明檢測GUS活性方法是非常靈敏的。為提高農桿菌介導的胡蘿卜直根瞬間表達體系的表達效率，實驗采用含有S1啟動子構建的農桿菌LBA4404真空滲透發(fā)育12周的胡蘿卜直根根片中，通過檢測GUS熒光活性值的變化來選擇最優(yōu)條件。根據實驗結果，最終選定的轉化條件為：Silwet

5、 1-77濃度：0.005％，滲透壓力：0.04MP-0.06MP，滲透時間：1-4min，轉化后培養(yǎng)時間：3-4天。由此我們利用真空滲透瞬間表達法研究了s Ⅱ基因的啟動子在胡蘿卜中表達的組織發(fā)育特異性及在直根中的高表達活性，同時建立起一套穩(wěn)定高效的農桿菌介導的胡蘿卜直根根片真空滲透瞬間表達體系。 為進一步探詢s Ⅱ基因啟動子的結構與功能，本文在全長啟動子S1的基礎上，用PCR方法擴增得到s Ⅱ基因啟動子的5’系列缺失體(S2-

6、S7)，并與報告基因GUS融合構建了七種植物表達載體pS2(1234bp)、pS3(674bp)、pS4(257bp)、pS5(136bp)、pS6(81bp)、pS7(56bp)。利用農桿菌介導的胡蘿卜直根瞬間表達體系來檢測這些植物表達載體表達GUS活性。GUS組織化學染色結果表明，除了缺失體S7沒有使胡蘿卜根片著色，其余缺失體轉化的胡蘿卜根片都有不同程度的GUS著色，其中E轉化的胡蘿卜根片著色范圍較小，著色程度較淺，其它缺失體之間的

7、GUS染色范圍，染色程度差異不明顯，對于直根的的四種組織來說，形成層及木質部著色程度較深，在周皮，韌皮部著色程度較淺。GUS熒光活性測定結果表明，啟動子S4表達載體表達了最高的GUS活性，是全長啟動子S1的2.11倍；S2是全長啟動子S1的1.37倍； S5與全長啟動子S1相近；而S6僅為全長啟動子的44.45％，但仍然顯著高于陰性對照N；S7與陰性對照N差異不顯著。由此推測在-2766bp--1234bp和一674bp--257bp兩

8、段區(qū)域可能存在負調控元件，而在-1234bp--674bp和-257bp--56bp之間可能存在正調控元件。在啟動子缺失分析的基礎上，本實驗利用5’RACE方法和生物信息學預測方法對該啟動子序列進行分析，初步確定了該啟動子的轉錄起始位點，其位于翻譯起始位點上游26bp處的“A”。同時結合缺失分析結果和啟動子預測軟件(PLACE和PlantCARE)初步推測在S4-S5之間可能存在增強子序列。由此我們對這段序列做一個加倍，然后正向插入到S