擬南芥抗致病疫霉相關(guān)基因ACS9的功能驗(yàn)證及其啟動(dòng)子活性研究.pdf

1、乙烯作為一種植物激素，對(duì)植物種子萌發(fā)、生長(zhǎng)發(fā)育、衰老、果實(shí)成熟、性別決定等都有著重要的影響，同時(shí)參與抵抗逆境脅迫如機(jī)械傷害、冷害、漬水、病原菌入侵等以及參與植物細(xì)胞的程序性死亡。ACC合酶是乙烯合成途徑中的限速酶，本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中利用致病疫霉接種不同生態(tài)型擬南芥，初步確定ACC合酶中的ACS9基因?yàn)榭怪虏∫呙瓜嚓P(guān)基因。為了深入研究ACC合酶參與抗致病疫霉的機(jī)制和信號(hào)傳導(dǎo)途徑，本試驗(yàn)利用反義RNA和RNAi技術(shù)對(duì)ACS9基因功能進(jìn)行了

2、初步研究?？寺×薃CS9基因上游不同長(zhǎng)度的調(diào)控序列，并構(gòu)建了GUS表達(dá)載體，研究了該基因的表達(dá)特性。結(jié)果如下：
　　 （1）構(gòu)建了ACS9基因反義RNA和RNAi載體pCAMBIA1300-ACS9A和pCAMBIA1300-ACS9i。將pCAMBIA1300-ACS9A和pCAMBIA1300-ACS9i載體經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥。通過潮霉素篩選，得到了18株反義RNA轉(zhuǎn)化子和13株RNAi轉(zhuǎn)化子。經(jīng)PCR鑒定，外源基因已成

3、功整合到了轉(zhuǎn)基因植株的基因組中。RT-PCR結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株中ACS9基因的表達(dá)均受到不同程度的抑制，確定所得轉(zhuǎn)基因植株均為ACS9基因的（反義RNA/RNAi）突變體。
　　 （2）經(jīng)RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，突變體病害防御反應(yīng)中乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的下游基因PDF1.2的表達(dá)受到了抑制；對(duì)突變體進(jìn)行暗培養(yǎng)，“三重反應(yīng)”消失；突變體接種致病疫霉后表現(xiàn)感病癥狀，確定ACS9基因參與了調(diào)控?cái)M南芥中乙烯介導(dǎo)的病害防御反應(yīng)。
　　

4、 （3）用PLACE和PLANTCARE軟件分析ACS9基因的啟動(dòng)子，發(fā)現(xiàn)該序列具有啟動(dòng)子的基本元件TATA-box和CAAT-box，此外還發(fā)現(xiàn)了光應(yīng)答元件G-Box、GATA和刺激誘導(dǎo)元件MBS和LTR等多個(gè)順式作用元件。
　　 （4）成功構(gòu)建了帶有GUS報(bào)告基因的含有ACS9基因不同長(zhǎng)度調(diào)控序列的植物表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)不同長(zhǎng)度的調(diào)控序列均具有啟動(dòng)子活性；GUS瞬時(shí)表達(dá)定量檢測(cè)與組織化學(xué)染色結(jié)果表明長(zhǎng)度為953 bp的調(diào)控序列啟