綠僵菌組成型啟動(dòng)子Pmagpd和特異啟動(dòng)子PMagas1的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、綠僵菌作為一類(lèi)重要的生物防治真菌，可寄生多種昆蟲(chóng)，在生產(chǎn)中已得到了廣泛應(yīng)用。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全世界約有兩百多種昆蟲(chóng)能被這種真菌感染致死。其具有觸殺性，無(wú)污染，防止再猖獗等優(yōu)點(diǎn)，但同其他生物農(nóng)藥一樣，綠僵菌也同時(shí)存在殺蟲(chóng)效果慢、易受環(huán)境影響和效果不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，因而一定程度上限制了其大規(guī)模應(yīng)用。因此，采用基因工程手段對(duì)菌株進(jìn)行改造，提高毒力、殺蟲(chóng)速度以及抗逆能力成為真菌殺蟲(chóng)劑研究的重要課題。
　　 目前，許多與毒力、抗逆相關(guān)的基因被逐

2、步克隆，包括參與體表附著階段的基因、參與表皮壁水解酶的基因、參與體壁穿透階段的基因以及參與體內(nèi)定植階段的基因等。這些都為昆蟲(chóng)病原真菌菌株的改良奠定了良好的基礎(chǔ)。對(duì)微生物的分子遺傳改造通常需要對(duì)目的基因進(jìn)行穩(wěn)定重復(fù)的表達(dá)。利用強(qiáng)啟動(dòng)子、某時(shí)期特異啟動(dòng)子或可誘導(dǎo)啟動(dòng)子表達(dá)內(nèi)外源基因?qū)τ诳茖W(xué)研究與實(shí)際應(yīng)用都有重要的意義。因此，利用高活力的啟動(dòng)子加強(qiáng)對(duì)上述毒力及抗逆基因的表達(dá)，是構(gòu)建高毒菌株的有效策略。
　　 本研究以綠僵菌為實(shí)驗(yàn)材料，

3、在已知序列的基礎(chǔ)上克隆了啟動(dòng)子的不同5’缺失片段，與報(bào)告基因GUS或EGFP融合，通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)化菌株報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄或表達(dá)分析組成型啟動(dòng)子PMagpd和附著胞時(shí)期特異啟動(dòng)子PMagas1的結(jié)構(gòu)和功能。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1.PMagpd的結(jié)構(gòu)與功能研究
　　 1.1 PMagpd生物信息學(xué)分析結(jié)果
　　 我們根據(jù)綠僵菌基因組序列設(shè)計(jì)引物，克隆Magpd上游約1700 bp的序列，命名為PMagpd

4、。與其他物種的gpd啟動(dòng)子進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)PMagpd啟動(dòng)子序列內(nèi)不包含一些常見(jiàn)的順式作用元件TATA-box和CAAT-box。與PgdpA的比對(duì)結(jié)果顯示，PMagpd內(nèi)包含一些gpd啟動(dòng)子共有的順勢(shì)作用元件gpd-box，pgk-box，qa-box，qut-box和ct-rich區(qū)域，以及一些可能參與反式作用因子結(jié)合的正向、反向重復(fù)序列。
　　 1.2轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證結(jié)果
　　 根據(jù)PMagpd功能元件的位置，克隆不同

5、長(zhǎng)度(1691 bp，1463 bp，946 bp，684bp，405 bp)的PMagpd的5’缺失片段，與GUS基因片段融合插入pK2載體，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化綠僵菌。對(duì)初篩轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR和southern blot驗(yàn)證，PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化子為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，雜交結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化子中PMagpd的拷貝數(shù)為1到3個(gè)不等。
　　 1.3 PMagpd缺失突變分析
　　 通過(guò)GUS酶活分析，結(jié)果顯示，與包含gpd-box的16

6、91 bp啟動(dòng)子區(qū)相比，不包含gpd-box的1463 bp的啟動(dòng)子活性無(wú)顯著差異，推測(cè)gpd-box對(duì)于PMagpd為非必需元件；960 bp和684 bp的啟動(dòng)子活性分別下降了34％和39％，說(shuō)明-1463bp～960 bp和-960 bp～-684 bp區(qū)域內(nèi)存在重要的啟動(dòng)子元件。將PMagpd與PgpdA比較，活性為PgpdA的1.3倍。RT-qPCR檢測(cè)GUS轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示啟動(dòng)子活性檢測(cè)結(jié)果與GUS酶活性分析結(jié)果一致。

7、r>　　 2.PMagas1的結(jié)構(gòu)與功能研究
　　 2.1 PMagas1生物信息學(xué)分析結(jié)果
　　 分析綠僵菌Magas1基因組序列，設(shè)計(jì)引物，克隆Magas1上游調(diào)控區(qū)約1228bp的序列，命名為PMagas1。對(duì)該調(diào)控序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在PMagas1中含有基本啟動(dòng)子元件CAAT-box，GC-box和TATA-box和真菌啟動(dòng)子通用元件ct-box以及一些可能與反式作用因子結(jié)合相關(guān)的正、反向重復(fù)序列。<

8、br>　　 2.2轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證結(jié)果
　　 以EGFP為報(bào)告基因，采用5’缺失方法構(gòu)建了不同長(zhǎng)度(1228 bp，897 bp，611 bp，377 bp)啟動(dòng)子的表達(dá)載體。通過(guò)PCR和Southern blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子，拷貝數(shù)為1到3個(gè)不等。
　　 2.3 PMagas1的時(shí)期特異性研究
　　 對(duì)含1228 bp的全啟動(dòng)子的綠僵菌轉(zhuǎn)化子各個(gè)時(shí)期進(jìn)行EGFP熒光觀察，發(fā)現(xiàn)只有在附著胞階段才能檢測(cè)到熒光信號(hào)；而在其

9、他生長(zhǎng)階段都沒(méi)有檢測(cè)到信號(hào)，包括孢子、萌發(fā)，菌絲和轉(zhuǎn)化子侵染的蝗蟲(chóng)期內(nèi)的蟲(chóng)生體。說(shuō)明該啟動(dòng)子僅在附著胞時(shí)期具有活性。
　　 2.4 PMagas1的缺失突變分析
　　 對(duì)各個(gè)缺失組的轉(zhuǎn)化子的EGFP基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平上的定量PCR分析，當(dāng)缺失了-1228 bp到-897 bp區(qū)域的De12組的活性沒(méi)有明顯的下降，而進(jìn)一步缺失了-897 bp到-611 bp(De13)的序列后，活性下降了接近70％，定點(diǎn)敲除掉-392 bp