硫化葉菌啟動(dòng)子Initiator元件功能研究.pdf

1、在真核生物中Initiator(Inr)對(duì)啟動(dòng)子活性的重要性已經(jīng)建立，且屬性研究的比較完善，它是位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)域的一個(gè)單向核心啟動(dòng)子元件，在含有TATA-box的啟動(dòng)子中鞏固啟動(dòng)子強(qiáng)度，而在不含有TATA-box的啟動(dòng)子中定位轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄方向。然而古菌的研究起步較晚，遺傳體系和遺傳操作并不如真核細(xì)胞發(fā)展的成熟，過去在古菌的TATA和Inr之間插入或刪除DNA序列，轉(zhuǎn)錄起始仍能有效進(jìn)行，因此人們認(rèn)為Inr在古菌中并不重要。僅有的

2、兩篇古菌Inr的報(bào)導(dǎo)只顯示轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)域的突變會(huì)降低啟動(dòng)子強(qiáng)度并影響轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的選擇，目前古菌Inr的具體屬性并沒有被深入研究，比如Inr的位置、長(zhǎng)度、序列偏好性、保守性。
　　古菌是真核生物在DNA復(fù)制、修復(fù)、轉(zhuǎn)錄和翻譯方面的簡(jiǎn)化版，故人們研究古菌不僅更了解其本身，也為了解真核細(xì)胞提供了模型和進(jìn)化上的參考。Kimberly B.Decker和Deborah M.Hinton發(fā)現(xiàn)細(xì)菌、古菌和真核生物的RNA合成中心在結(jié)構(gòu)和功能

3、上相似，啟動(dòng)子模塊從細(xì)菌到人類普遍保守，細(xì)菌、古菌和真核生物在核心啟動(dòng)子內(nèi)和靠近核心啟動(dòng)子區(qū)域的調(diào)控策略相似，都會(huì)采取不同的核心啟動(dòng)子元件的組合。真核Inr是啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)多樣性貢獻(xiàn)于轉(zhuǎn)錄調(diào)控多樣性的代表性元件，本文對(duì)古菌Inr的研究不僅有助于了解古菌啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄起始機(jī)制，也將對(duì)古菌核心啟動(dòng)子水平的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有更深入的認(rèn)識(shí)。
　　得益于本課題組近年發(fā)展起來的Sulfolobus遺傳操作體系，包括有效的pyrEF營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選和基于l

4、acS的顏色篩選，以及E.coli-Sulfolobus穿梭質(zhì)粒pZC1，我們可以用重疊延伸PCR和反向PCR構(gòu)建多種Inr突變啟動(dòng)子，將這些Inr突變啟動(dòng)子和報(bào)告基因lacS融合插入pZC1，以Sulfolobus islandicus E233S pyrEF/lacS雙突變菌株作為宿主，得到相應(yīng)的轉(zhuǎn)化子。比較各個(gè)轉(zhuǎn)化子的lacS比活性，根據(jù)lacS酶活性的變化確定突變對(duì)表達(dá)的影響，并采用RT-qPCR和引物延伸實(shí)驗(yàn)確定突變對(duì)轉(zhuǎn)錄的影

5、響，然后計(jì)算翻譯水平的影響。
　　硫化葉菌阿拉伯糖操縱子有4個(gè)基因araS(Arabinose binding protein)，araT和araU(Permease)還有araV(ATPase)，本課題組對(duì)araS啟動(dòng)子的研究有一定的基礎(chǔ)，araS Inr成為我們的首要研究對(duì)象，啟動(dòng)子+1到+6突變對(duì)酶活有劇烈影響支持了此處含有Inr的假設(shè)，進(jìn)一步的引物延伸和RT-qPCR證實(shí)這是一個(gè)影響轉(zhuǎn)錄的元件，而對(duì)翻譯的影響有限。在無ar

6、a-box的啟動(dòng)子T6BRE的基礎(chǔ)上突變Inr，酶活下降為D-55的2.1％，基本失去活性，這說明Inr并不止在受誘導(dǎo)的araS啟動(dòng)子中才起作用，而是基礎(chǔ)啟動(dòng)子發(fā)揮活性所必須的基本啟動(dòng)子元件。在T6BRE的基礎(chǔ)上突變TATA-box，酶活完全喪失，說明Inr對(duì)啟動(dòng)子的貢獻(xiàn)依賴于TATA-box。araS Inr的系統(tǒng)突變發(fā)現(xiàn)在araS啟動(dòng)子中天然Inr功能最強(qiáng)，序列偏好性可以總結(jié)為+1GAKAMY+6(IUPAC，K=G或T;M=A或C

7、;Y=T或C)，這可以幫助我們鑒別潛在的Inr和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，也是尋找Inr結(jié)合蛋白的必要信息。
　　另一方面生物信息學(xué)方法被用來分析S.solfataricus P2487個(gè)基因的保守Inr序列，配合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)得到的堿基偏好性對(duì)比分析。S.solfataricus P2生物信息學(xué)比對(duì)得出的-1YRWKAAA+6的保守序列與araS Inr非常相似，分類比對(duì)發(fā)現(xiàn)Inr傾向存在于UTR≥4的基因中，不同功能基因的比對(duì)發(fā)現(xiàn)Inr在能量代

8、謝基因中非常保守。序列比對(duì)證明不是所有基因都含有Inr，這和S.islandicus中體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)應(yīng)，同樣受阿拉伯糖調(diào)控的SiRe0562、SiRe2130、SiRe2129和SiRe2125并不含有Inr。但突變含有Inr的基因，不論是araS還是隨機(jī)選擇的Sso1934、Sso3180和Sso1171，酶活都顯著降低。
　　把a(bǔ)raS Inr插入無Inr基因SiRe0562、sso0009和sso1029的啟動(dòng)子中，它們的

9、表達(dá)得到了增強(qiáng)。細(xì)胞對(duì)有和沒有Inr的基因進(jìn)行差異調(diào)控，這可能基于TFB和RNA聚合酶與Inr的結(jié)合，這種機(jī)制與σ家族介導(dǎo)的細(xì)菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控和Halophile中GTFs組合參與的全局調(diào)控相似。Sulfolobus只編碼一個(gè)TBP和兩個(gè)有功能的TFBs，TFB或RNA聚合酶與Inr親和度的差異正好可以彌補(bǔ)有限的GTFs，增加轉(zhuǎn)錄調(diào)控的可能。
　　總的來說，本研究通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和生物信息學(xué)分析鑒定到古菌中保守的Inr,發(fā)現(xiàn)Inr對(duì)轉(zhuǎn)錄很重