油菜種子特異表達(dá)啟動(dòng)子pFAE1和pNapB的結(jié)構(gòu)與功能比較研究.pdf

1、隨著生物技術(shù)的發(fā)展，植物種子不但是傳統(tǒng)農(nóng)產(chǎn)品的載體，還是高價(jià)值化學(xué)品和醫(yī)藥產(chǎn)品的載體。通過基因工程定向改變植物種子成分成為本世紀(jì)農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新的重要組成部分。
　　 植物種子特異表達(dá)啟動(dòng)子是植物種子基因調(diào)控不可缺少的基因元件。啟動(dòng)子的組織特異性、作用強(qiáng)弱和時(shí)空表達(dá)特點(diǎn)是對基因進(jìn)行精確調(diào)控的關(guān)鍵。本研究的目的是從油菜中克隆種子特異表達(dá)啟動(dòng)子pNapB和pFAE1，對他們的序列結(jié)構(gòu)、作用強(qiáng)度和時(shí)空表達(dá)特點(diǎn)進(jìn)行比較研究。
　　

2、通過同源序列法從油菜品種中油821中分離得到油菜種子儲(chǔ)藏蛋白基因NapB和油菜脂肪酸延長酶基因FAE1的上游啟動(dòng)子序列pNapB和pFAE1，其中pNapB長1136 bp，pFAE1長1420 bp。生物信息學(xué)分析表明，兩種啟動(dòng)子的核苷酸序列都含有種子特異表達(dá)啟動(dòng)子的順式作用元件，包括RY重復(fù)、G-box和E-box等，但兩種啟動(dòng)子順式作用元件的序列分布不同。NapB啟動(dòng)子序列分析發(fā)現(xiàn)具有ABA應(yīng)答元件中的distB 和proxB,也

3、被稱為B-boxABA應(yīng)答復(fù)合物以及GCN4模序，而FAE1啟動(dòng)子序列分析沒有發(fā)現(xiàn)典型的B-box ABA應(yīng)答復(fù)合物和GCN4模序。
　　 將pNapB和pFAE1兩個(gè)啟動(dòng)子分別與報(bào)告基因GUS融合并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入煙草，得到大量轉(zhuǎn)基因煙草植株。組織化學(xué)分析表明，兩種啟動(dòng)子基本上是種子特異性表達(dá)的，但是都有滲漏表達(dá)，并且它們在種子中作用的時(shí)間和空間分布以及作用強(qiáng)度明顯不同。pNapB啟動(dòng)子比pFAE1作用開始的時(shí)間早，持續(xù)時(shí)

4、間長，在早期作用比pFAE1強(qiáng)，但pFAE1啟動(dòng)子在種子發(fā)育中期啟動(dòng)速度快，成熟種子的GUS染色深度在兩種啟動(dòng)子間差別不大。熒光定量PCR分析表明，pNapB-GUS mRNA在開花后12天開始表達(dá)，而pFAE1-GUS mRNA的表達(dá)開始較晚。pNapB-GUS mRNA的最高表達(dá)量是pFAE1-GUS mRNA的20倍。
　　 將pNapB和pFAE1兩個(gè)啟動(dòng)子分別與報(bào)告基因GUS融合并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入油菜中，只得到了p

5、FAE1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)化植株。對T1代轉(zhuǎn)基因油菜進(jìn)行組織化學(xué)分析結(jié)果表明，除了油菜種子外，在葉片和根部也能微弱的染上藍(lán)色，說明本研究中pFAE1啟動(dòng)子的種子特異性不是很強(qiáng)。轉(zhuǎn)pFAE1-GUS基因的油菜在開花后25天時(shí)種子的珠柄處開始染上藍(lán)色，隨著種子的成熟，胚珠被染上藍(lán)色并逐漸加深，但是種皮不能染上顏色。
　　 利用RT-PCR技術(shù)對不同發(fā)育時(shí)期油菜種子中的內(nèi)源FAE1和NapB基因表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果表明，NapB mRNA的