蠟梅CpAGL6基因啟動子的克隆及功能的初步分析.pdf

1、MADS-box基因是一類廣泛存在于植物界的基因家族，是植物生長發(fā)育過程中非常重要的調(diào)控因子，如參與調(diào)節(jié)營養(yǎng)生長、種皮發(fā)育、子房發(fā)育、胚形態(tài)建成、根的形成和共生誘導(dǎo)等。目前對MADS-box基因調(diào)控機(jī)理的研究已成為植物分子生物學(xué)領(lǐng)域中的一大熱點(diǎn)。AGL6亞家族基因?qū)儆贛ADS-box基因MIKC家族，為AP1/A GL9組的一個遺傳冗余基因。研究表明AGL6基因是與花器官發(fā)育相關(guān)的基因。
　　重慶市花卉工程技術(shù)研究中心在前期工作中

2、已從蠟梅(Chimonanthus praecox(L.) Link)中克隆了CpAGL6基因(GenBank登錄號為FJ807387)，長度為948 bp。提取蠟梅不同組織和不同時期花芽RNA進(jìn)行RT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)該基因在蠟梅花器官中特異表達(dá)，并且參與花原基的形成等。啟動子是轉(zhuǎn)錄水平上的一個重要調(diào)控元件，通過與多種轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，進(jìn)而決定了基因的時空表達(dá)模式及表達(dá)強(qiáng)度。目前，AGL6基因已被大量分離并研究，但是還未見到AGL6基因

3、啟動子研究的相關(guān)報道。為了弄清CpAGL6基因啟動子在植物體內(nèi)的表達(dá)特性，我們從蠟梅中克隆得到了該基因的上游調(diào)控序列，并對啟動子的功能進(jìn)行了初步分析，本文主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.在CpAGL6基因ORF的5'端設(shè)計三條巢式引物，利用hiTAIL-PCR法從蠟梅基因組中克隆到花發(fā)育相關(guān)基因CpAGL6翻譯起始位點(diǎn)上游1266 bp的啟動子序列。生物信息學(xué)分析表明，該啟動子序列中包含啟動子的基本元件TATA-box和CAAT

4、-box及多個與植物非生物脅迫相關(guān)的響應(yīng)元件。
　　2.為進(jìn)一步分析CpAGL6啟動子的功能，構(gòu)建了該基因啟動子與GUS基因融合的植物表達(dá)載體，并用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草。在煙草葉片中的瞬時表達(dá)結(jié)果表明該啟動子序列具備驅(qū)動報告基因GUS表達(dá)的功能。
　　3.將經(jīng)卡那霉素(Kanamycin)篩選后的抗性苗，進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色分析和PCR分子驗(yàn)證，獲得轉(zhuǎn)基因煙草株系。
　　4.對轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色及GUS

5、酶活性定量檢測，結(jié)果顯示，CpAGL6基因啟動子能夠驅(qū)動GUS基因在轉(zhuǎn)基因煙草的葉，莖和花中表達(dá)，并且在不同花期表達(dá)強(qiáng)度存在差異，根中幾乎不表達(dá)。結(jié)果表明，CpAGL6啟動子主要驅(qū)動GUS報告基因在花器官和綠色器官組織中表達(dá)。
　　5.轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)黑暗、赤霉素(GA3)和低溫處理后，GUS酶活力均有所增加。結(jié)果表明，CpAGL6啟動子可能在抵抗非生物脅迫中起到非常重要的作用。
　　6.對T2代轉(zhuǎn)基因煙草幼苗進(jìn)行GUS時間表達(dá)