大豆中疫霉菌特異誘導(dǎo)性啟動(dòng)子的人工設(shè)計(jì)與功能研究.pdf

1、大豆作為世界上一種非常重要的油料作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人們生活中扮演著重要的角色。而由大豆疫霉引起的大豆根腐病是一種毀滅性的病害，每年都會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前尚未有有效手段預(yù)防和控制該種病害的發(fā)生。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究者將目光投向了基因工程，企圖通過克隆抗病相關(guān)的基因，來(lái)推動(dòng)大豆抗疫霉病的進(jìn)程。而病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的克隆與利用作為基因工程中重要的一部分，受到越來(lái)越多的重視。啟動(dòng)子的本質(zhì)是一段存在于基因中的脫氧核苷酸序列。它的作用是與RN

2、A聚合酶結(jié)合并開啟下游基因的轉(zhuǎn)錄。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子作為啟動(dòng)子的一種，廣泛存在于植物的基因中。在受到特定誘導(dǎo)物刺激后，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子活性增強(qiáng)，使得其下游基因的表達(dá)水平明顯提高。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以應(yīng)用于基因工程中，為植物的抗脅迫和抗病作出貢獻(xiàn)。本文通過對(duì)疫霉菌特異誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的分析，得到了相應(yīng)的疫霉誘導(dǎo)型啟動(dòng)子順式元件，并對(duì)人工設(shè)計(jì)合成的啟動(dòng)子受疫霉誘導(dǎo)表達(dá)的情況進(jìn)行了研究。同時(shí)，在研究中我們利用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，大豆中仍缺少合適的內(nèi)參

3、基因，所以我們?cè)诖蠖怪羞M(jìn)行了內(nèi)參基因的篩選。
　　啟動(dòng)子中存在不同的作用元件，而元件間不同的位置及組合關(guān)系影響著啟動(dòng)子的特性。已有文章報(bào)道了不同作用元件對(duì)于啟動(dòng)子的重要性，它們可能在植物響應(yīng)環(huán)境脅迫或病原物侵染等方面起著重要作用。在基因工程中，作用元件也被廣泛應(yīng)用于人工合成啟動(dòng)子中。本實(shí)驗(yàn)室已對(duì)超大規(guī)?；蛐酒M(jìn)行了分析，得到了不同大豆品系在疫霉接種前后不同時(shí)間點(diǎn)的全基因表達(dá)譜，并獲得了180個(gè)疫霉誘導(dǎo)型基因。本研究在此基礎(chǔ)之上，

4、利用生物信息學(xué)方法對(duì)已獲得的180個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行了系統(tǒng)分析，找到了25個(gè)未報(bào)到過的結(jié)構(gòu)元件，并對(duì)這些結(jié)構(gòu)元件經(jīng)行了設(shè)計(jì)和組合，構(gòu)建成不同的合成啟動(dòng)子。在煙草瞬時(shí)表達(dá)體系中，對(duì)人工設(shè)計(jì)的啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)分析、功能驗(yàn)證與優(yōu)化。通過實(shí)驗(yàn)我們得到了8個(gè)受疫霉誘導(dǎo)表達(dá)的人工合成啟動(dòng)子，為大豆轉(zhuǎn)基因抗疫霉病害的品種設(shè)計(jì)提供了參考。
　　實(shí)時(shí)定量PCR可以在反應(yīng)進(jìn)行過程中對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)的分析和檢測(cè)，相較于常規(guī)的PCR通過終點(diǎn)法來(lái)檢測(cè)分析

5、擴(kuò)增產(chǎn)物來(lái)說，實(shí)時(shí)定量PCR具有更高的效率。在實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)中，內(nèi)參基因的選擇非常重要，因?yàn)閮?nèi)參基因是用來(lái)作為目標(biāo)基因表達(dá)量分析的標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)文獻(xiàn)中關(guān)于大豆內(nèi)參基因的研究，本實(shí)驗(yàn)以大豆的不同組織以及大豆疫霉誘導(dǎo)下大豆根為材料，使用熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法分析了Cons4、ACT11、TUA soy、Cons15、ACT20、Cons7、CYP2、Cons6、Tubulin和ELF1B10個(gè)持家基因的表達(dá)情況。通過BestKeeper、G