本氏煙與番茄AtTOM類基因克隆與功能初步分析.pdf

1、在病毒侵染植物過(guò)程中由于病毒本身只攜帶少量的基因，其編碼的蛋白遠(yuǎn)不足以完成整個(gè)病毒侵染過(guò)程，因此必需借助于寄主因子來(lái)實(shí)現(xiàn)侵染。近年來(lái)己在植物中發(fā)現(xiàn)一些寄主因子與病毒的復(fù)制有關(guān)，如擬南芥中的AtTOM1基因與煙草花葉病毒(TMV)的復(fù)制相關(guān)，三生煙上鑒定的NtTOM1和NtTOM3及本氏煙上鑒定的NbTOM1也與TMV的復(fù)制相關(guān)。 本論文根據(jù)已報(bào)道的三生煙的NTOM1和NtTOM3基因序列(AB193039．AB193040)設(shè)計(jì)

2、特異引物，利用RT-PCR從本氏煙擴(kuò)增到NbTOM1和NbTOM3的基因片段。序列分析表明，NbTOM1和NbTOM3與三生煙中NtTOM1和NtTOM3的同源性分別為95.9％和98.2％。將NbTOM1和NbTOM3插入到煙草曲莖病毒(TbCSV)衛(wèi)星分子DNA1的沉默載體中，得到DNA1：TOM1、DNA1：TOM3和DNA1：TOM1-TOM3三個(gè)重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒利用三親交配法導(dǎo)入農(nóng)桿菌，并與中國(guó)番茄黃化曲葉病毒(TYLCCN

3、V)共同接種本氏煙。接種14天后半定量PCR分析表明，在接種了DNA1：TOM1的植株中NtTOM1基因被沉默而NtTOM3的mRNA水平未受影響：而接種了DNA1：TOM3的植株中NtTOM3基因被沉默而NtTOM1的mRNA水平未受影響：接種DNA1：TOM1-TOM3的植株，兩個(gè)基因被同時(shí)沉默。沉默植株接種TMV：GFP，GFP觀察和Northern blot分析表明，單獨(dú)沉默NbTOM1或NbTOM3與兩者同時(shí)沉默的植株中TMV

4、病毒的增殖受抑制。上述結(jié)果表明，NbTOM3可能與NbTOM1具有相似的機(jī)制支持TMV復(fù)制。 利用已報(bào)道的番茄中AtTOM1類基因序列(AB193041，AB193042，AB193043)設(shè)計(jì)的特異引物從番茄中擴(kuò)增了AtTOM1類基因片段(LeTH1，LeTH2，LeTH3)，并將其插入同一TbCSV衛(wèi)星分子DNA1沉默載體中獲得重組質(zhì)粒DNA1：LeTH1-LeTH2-LeTH3。重組質(zhì)粒利用三親交配法導(dǎo)入農(nóng)桿菌后與TYLC

5、CNV共同接種番茄。接種20天后半定量PCR分析表明，重組質(zhì)粒與TYLCCNV共同接種番茄后，幾個(gè)基因可同時(shí)被沉默，當(dāng)沉默后的植株接種TMV：GFP后，GFP觀察和Northern blot分析表明TMV復(fù)制受抑制。這幾個(gè)基因分別對(duì)TMV復(fù)制的影響及是否存在功能冗余還有待進(jìn)一步的分析。 本論文所用的TbCSV DNA1沉默體系，其沉默效率高，接種植物無(wú)癥狀，可以有效地用于快速鑒定基因功能。而利用VIGS體系沉默寄主植物的TOM類