哈氏弧菌dam基因的克隆與分析.pdf

1、DNA甲基化在生物界是一種普遍機(jī)制，幾乎存在于所有生命體中。目前己發(fā)現(xiàn)的甲基化皆由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase)所介導(dǎo)，該酶能夠利用S-腺苷甲硫氨酸為底物，將其甲基轉(zhuǎn)移至腺嘌呤(A)的N6或胞嘧啶(C)的C5或N4位置上。DNA甲基化最早是作為限制一修飾系統(tǒng)的一個(gè)組成部分而被發(fā)現(xiàn)的，該系統(tǒng)是生物在長期進(jìn)化過程中形成的一種自我保護(hù)機(jī)制，其中甲基轉(zhuǎn)移酶所起的作用是甲基修飾某些特定序列中的腺嘌呤或胞嘧啶，以此特

2、征將自身DNA與異源DNA區(qū)別開來。隨后的研究發(fā)現(xiàn)一些獨(dú)立存在的甲基轉(zhuǎn)移酶，其功能與限制一修飾無關(guān)。DNA腺嘌呤甲基化酶(DNA adenine methylase，Dam)即是這種類型的酶之一。Dam廣泛存在于細(xì)菌中，如大腸桿菌，沙門氏桿菌，耶爾森氏菌，奈瑟菌，以及霍亂弧菌等。與限制一修飾系統(tǒng)中的甲基化酶不同，Dam參與細(xì)胞生理代謝過程中的許多重要方面，如DNA復(fù)制，基因表達(dá)，甲基化介導(dǎo)的錯(cuò)配修復(fù)，換位等。近年來研究表明在某些人類病原

3、菌中Dam與細(xì)菌致病力密切相關(guān)，其基因敲除導(dǎo)致細(xì)菌毒力大幅下降。基于其在細(xì)胞生命過程中所起的多種作用，dam基因的研究將有助于加深我們對細(xì)菌生命機(jī)制的理解。 弧菌是海洋環(huán)境中最常見的細(xì)菌類群之一，且大量存在于各種水生環(huán)境中?；【贫喾N屬是人類或養(yǎng)殖動(dòng)物病原性細(xì)菌，其中哈氏弧菌(Vibrio barveyi)能夠感染多種養(yǎng)殖水生生物(蝦、魚、貝等)，是危害我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要病原菌之一。本實(shí)驗(yàn)所用哈氏弧菌T4為我們從患病大菱鲆

4、腸道內(nèi)分離出的一株病原菌。 (1)T4基因組DNA經(jīng)提取純化后分別用DpnⅠ、DpnⅡ和 Sau3AI酶切，酶切結(jié)果經(jīng)0.8％瓊膠糖凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)T4 DNA對DpnⅠ和Sau3AI敏感，而對DpnⅡ則具有抗性，說明該菌中存在具功能活性的DNA腺嘌呤甲基化酶，在其作用下T4染色體DNA處于被甲基化狀態(tài)。 (2)利用兼并PCR，染色體步移法的方法克隆得到哈氏弧菌T4的DNA腺嘌呤甲基化酶基因，序列分析表明該基因編碼279個(gè)

5、氨基酸，與其它已知弧菌的Dam具有較高的同源性，其中與副溶血弧菌Dam的相同性達(dá)95％。功能檢驗(yàn)表明所克隆的dam基因在大腸桿菌中具有DNA腺嘌呤甲基化酶活性，能夠甲基化大腸桿菌染色體DNA GATC序列中的腺嘌呤。 (3)運(yùn)用染色體步移法獲得dam基因上游的3251 bp DNA，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域含有3個(gè)基因，其與dam在染色體上的相對排列順序?yàn)椋好Р菟峒っ?脫氫奎尼酸合成酶-damX-dam。 (4)對dam上游DNA序列