哈維弧菌Vh-TAA的基因克隆表達(dá)分析和粘附活性研究.pdf

1、上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文碩士學(xué)位論文題目：目：哈維弧菌哈維弧菌VhTAA的基因克隆表達(dá)分析和粘附活性研究的基因克隆表達(dá)分析和粘附活性研究英文題目：英文題目：VhTAAGeneCloningExpressionAnalysisAdhesionActiveResearchinVibrioharveyi專業(yè)：業(yè)：臨床獸醫(yī)研究方向：研究方向：漁業(yè)生物病害姓名：名：劉金葉指導(dǎo)教師：指導(dǎo)教師：馮娟副研究員上海海洋大學(xué)，上海，200090中國水產(chǎn)科學(xué)

2、院南海水產(chǎn)研究所，廣州，510300學(xué)校代碼：10264研究生學(xué)號(hào)：M090104209上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文I哈維弧菌哈維弧菌VhTAA的基因克隆表達(dá)分析和粘附活性研究的基因克隆表達(dá)分析和粘附活性研究摘要哈維弧菌（Vibrioharveyi）屬于革蘭氏陰性菌，廣泛存在于海水環(huán)境中，是海水養(yǎng)殖動(dòng)物的一種常見致病菌，可引起多種海水養(yǎng)殖動(dòng)物發(fā)病，且死亡率高、影響范圍廣，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。病原菌的致病過程中粘附是引發(fā)宿主感染

3、的第一步，而粘附素作為病原菌一個(gè)重要毒力因子在細(xì)菌的粘附過程中起著重要的作用。隨著對(duì)病原菌致病機(jī)理研究的不斷深入，人們?cè)诟锾m陰性菌中發(fā)現(xiàn)了一類新的粘附素—三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)粘附素（TrimericAutotranspterAdhesions，TAA），這類廣泛存在于變形菌門，它們?cè)诎被蛄泻托蛄写笮∩洗嬖诟叨鹊牟町悾谴_具有相似的結(jié)構(gòu)特征：即包含N末端信號(hào)肽、中間的承載結(jié)構(gòu)域和C末端的轉(zhuǎn)運(yùn)單位，其中他們的C末端的轉(zhuǎn)運(yùn)單位在所有的TAA中是同

4、源的，并成為定義TAA的一個(gè)標(biāo)志性區(qū)域。TAA作為革蘭氏陰性菌與宿主細(xì)胞相互作用的重要毒力因子，已成為當(dāng)前研究病原菌致病機(jī)制的熱點(diǎn)。目前在哈維弧菌中還未見有關(guān)TAA的報(bào)道，我們通過同源比對(duì)后采用基因步移的方法成功獲得了哈維弧菌的一個(gè)636bp的開放閱讀框（F），該F編碼212個(gè)氨基酸，經(jīng)SMART軟件分析發(fā)現(xiàn)該氨基序列具有顯著的TAA的結(jié)構(gòu)特征，采用信號(hào)肽序列分析軟件分析發(fā)現(xiàn)該氨基序列包含一個(gè)122aa的信號(hào)肽序列，對(duì)其預(yù)測的同源的C末

5、端的轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域進(jìn)行二級(jí)機(jī)構(gòu)比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)它們都包含4個(gè)β折疊和一個(gè)與其相連的Coiledcoil片段，最后經(jīng)daTAA驗(yàn)證分析，證實(shí)獲得的序列為哈維弧菌的一個(gè)三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素VhTAA。為了研究該蛋白的生物學(xué)功能，通過分析對(duì)預(yù)測的承載結(jié)構(gòu)區(qū)域進(jìn)行了原核表達(dá)，因?yàn)槌休d結(jié)構(gòu)區(qū)域是TAA的功能區(qū)域。我們成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pRSETAvhp，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21(DE3)plysS，經(jīng)IPTG28C誘導(dǎo)表達(dá)，SDSPAGE蛋白電泳分