哈茨木霉Chit37基因與Thi4基因的克隆與表達(dá).pdf

1、絲狀土壤真菌哈茨木霉（Trichodermaharzianum）作為一種優(yōu)秀的生防因子具有廣泛的作用譜，在生物防治和環(huán)境保護(hù)方面發(fā)揮著重要作用。為了從基因組水平上探討其生防機(jī)理并挖掘生防相關(guān)新基因，本實(shí)驗(yàn)室以膠態(tài)幾丁質(zhì)為唯一碳源，構(gòu)建哈茨木霉（T.harzianum）菌絲體時(shí)期誘導(dǎo)表達(dá)的cDNA文庫(kù)并獲得1,386條EST序列（序列號(hào)：DY761370～DY762921），通過(guò)生物信息學(xué)分析成功獲得了2條新基因（幾丁質(zhì)酶基因Chit37

2、和噻唑生物合成酶基因Thi4），GenBank序列接受號(hào)分別為DQ647957和DQ647956。
　　Chit37基因的氨基酸序列含有幾丁質(zhì)酶18家族保守活性位點(diǎn)“FDGIDIDIE”，該基因家族因具有降解幾丁質(zhì)活性而在植物病害生物防治、海洋垃圾降解及資源的再生利用過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，全新堿性幾丁質(zhì)酶基因Chit37的開(kāi)發(fā)和研究將豐富基因資源，為高效工程菌的構(gòu)建提供重要材料。Chit37基因原核表達(dá)優(yōu)化條件為0.1mmol/L

3、IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)8h，這一結(jié)果對(duì)于后續(xù)研究及大規(guī)模發(fā)酵具有重要的指導(dǎo)意義。通過(guò)穿梭質(zhì)粒pYES2實(shí)現(xiàn)基因Chit37在釀酒酵母（S.cerevisiae）H158中的外源表達(dá)，考慮到非翻譯區(qū)域?qū)Ρ磉_(dá)產(chǎn)物的可能影響，使用兩種目的片段Chit37-I（包含非翻譯區(qū)的全長(zhǎng)序列）和Chit37-II（只含有開(kāi)放讀碼框序列）；半定量RT-PCR結(jié)果表明，Chit37-I在誘導(dǎo)后96h和108h表達(dá)量較高，而Chit37-II則在誘導(dǎo)后84h和96

4、hmRNA轉(zhuǎn)錄水平較高。DNS法檢測(cè)轉(zhuǎn)化子發(fā)酵周期，當(dāng)接種比例為1:100時(shí)CHIT37-I和CHIT37-II轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)酶高峰分別為第108h和96h，最適反應(yīng)溫度、pH值及底物濃度均為40℃、5.0及5％，CHIT37-II具有發(fā)酵周期短、酶活性高且對(duì)底物濃度適應(yīng)范圍廣等特點(diǎn)而在大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)中更具優(yōu)勢(shì)，對(duì)于非翻譯區(qū)作用的探討將有助于今后對(duì)Chit37基因的合理利用。
　　構(gòu)建表達(dá)載體pPKTCP，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入生防

5、真菌哈茨木霉（T.harzianum）中，分子生物學(xué)檢測(cè)表明，Chit37基因以單拷貝形式整合到哈茨木霉基因組DNA中且都能夠穩(wěn)定遺傳，轉(zhuǎn)化子對(duì)病原菌的抑制率顯著高于原始菌株，對(duì)六種病原菌的拮抗能力由強(qiáng)至弱分別是核盤(pán)菌（S.sclerotiorum）、立枯絲核菌（R.solani）、尖鐮孢菌（F.oxysporum）、齊整小核菌（S.rolfsii）、茄腐鐮刀菌（F.moniliforme）、和灰霉病菌（B.cinerea）。這一結(jié)果說(shuō)

6、明CHIT37具有抗真菌活性并在哈茨木霉生物防治過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，轉(zhuǎn)化子可直接以菌劑形式應(yīng)用于病害防治，具有非常重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，并有助于促進(jìn)生物防治的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。
　　Thi4基因與Thi4家族具有較高的同源性，該基因家族的功能與逆境脅迫相關(guān)，作為維生素B1生物合成途徑中的關(guān)鍵酶而間接參與有機(jī)體新陳代謝，同時(shí)噻唑作為多種農(nóng)藥內(nèi)核被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。因此，Thi4基因的研究對(duì)生物法大量生產(chǎn)維生素B1、生物合成新型