克氏原螯蝦α-淀粉酶基因的克隆與功能分析.pdf

1、克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）又稱小龍蝦，在分類學上隸屬于節(jié)肢動物門、甲殼綱，是一種重要的淡水養(yǎng)殖蝦品種。在其整個生命周期中，蛻皮次數(shù)高達十幾次，且只有經(jīng)過蛻皮才能實現(xiàn)性成熟。而蛻皮受到多種因素的調控，其中消化酶類扮演者重要的角色。本研究克隆了克氏原螯蝦α-淀粉酶基因并分析了蛻皮激素對α-淀粉酶表達水平的影響。
　　本實驗根據(jù)已有部分序列，設計特異性引物克隆出克氏原螯蝦α-淀粉酶ORF（open readin

2、g frame）cDNA序列。生物信息學分析表明克氏原螯蝦α-淀粉酶ORF長1545bp,編碼的蛋白質含514個氨基酸殘基，其氨基端19個疏水性氨基酸殘基為信號肽。預測的成熟蛋白的理論相對分子量為55.1 kDa,等電點為4.95.通過雙酶切法構建重組質粒 pET-28a-amy，轉化至 E. coli Rosetta(DE3)，用不同濃度 IPTG進行誘導表達。SDS-PAGE電泳和 Western blot的檢測結果表明克氏原螯蝦α

3、-淀粉酶融合蛋白能夠在原核表達系統(tǒng)中高效表達，但是重組蛋白質主要以包涵體形式存在。用 Ni-NTA親和層析柱對α-淀粉酶重組蛋白包涵體進行純化并免疫制備多克隆抗體，ELISA檢測其抗體效價為1:60000。透析法復性純化后的重組蛋白，DNS法測定其酶活為1425±28 U/mg。
　　提取克氏原螯蝦肝胰腺、心臟、腸道、胃、肌肉、鰓6個不同組織的總蛋白和總RNA,通過免疫印跡法和實時定量PCR法分析克氏原螯蝦α-淀粉酶的組織表達差異