克氏原螯蝦新型過敏原的鑒定與性質(zhì)研究.pdf

1、近年來，食物過敏性疾病的發(fā)病率迅速增高。隨著克氏原螯蝦消費(fèi)量的日益增長及加工產(chǎn)品多樣化，其引發(fā)的食物過敏病例常有出現(xiàn)，嚴(yán)重地影響著人們的生活質(zhì)量。所以，針對克氏原螯蝦引起過敏問題的研究具有重要意義。本文以克氏原螯蝦為試驗(yàn)對象，繼續(xù)尋找新型過敏原，研究其分離純化、理化特性分析及抗原表位的確定，為開發(fā)低致敏性克氏原螯蝦產(chǎn)品提供理論依據(jù)，同時為甲殼類過敏性疾病的診斷和治療提供幫助。
　　利用甲殼類過敏患者血清IgE的Western-bl

2、otting技術(shù)，確定克氏原螯蝦肌肉中28 kDa蛋白為其過敏組分。采用硫酸銨分步鹽析、連續(xù)柱層析（Q-Sepharose、Sephacryl S-200）的方法純化得到28 kDa蛋白，經(jīng)肽指紋質(zhì)量圖譜鑒定其為磷酸丙糖異構(gòu)酶(triosephosphateisomerase，TIM)，并通過免疫新西蘭兔制備抗TIM多克隆抗體。理化特性分析結(jié)果顯示，TIM是一種糖含量為0.82％的糖蛋白;TIM不耐熱，高溫處理可破壞其二級結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其Ig

3、E結(jié)合活性明顯下降;TIM在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿條件下不易被降解，但強(qiáng)堿處理使其IgG結(jié)合活性下降，而強(qiáng)酸環(huán)境使其IgE結(jié)合活性有所上升;TIM耐胰液消化，易被胃蛋白酶降解但其消化產(chǎn)物仍存在IgE結(jié)合活性;TIM存在多態(tài)性，含TIM1、TIM2、TIM3三種亞基，且TIM1、TIM2具有免疫活性;TIM的空間結(jié)構(gòu)為典型的(β/α)8-barrel結(jié)構(gòu)，分析模擬出6個構(gòu)象型IgG表位和5個線性IgG表位。
　　與此同時，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)克氏原螯蝦肌

4、肉中90 kDa蛋白可與兔抗克氏原螯蝦TIM多克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合且具有IgE結(jié)合活性，分析其為一種新型過敏組分。采用硫酸銨分步鹽析及陰離子交換柱層析(Q-Sepharose)的方法純化得到90 kDa蛋白，經(jīng)肽指紋質(zhì)量圖譜鑒定其為細(xì)絲蛋白c（filamin C，F(xiàn)LN c）。理化特性分析表明，F(xiàn)LN c含糖量為0.98％;FLN c對熱不穩(wěn)定，高溫處理可破壞其二級結(jié)構(gòu)使其IgE結(jié)合活性顯著下降;FLN c耐堿不耐酸;FLNc可被消化

5、酶降解，但其消化產(chǎn)物仍保留免疫活性;FLN c具有復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，分析模擬出8個構(gòu)象型IgG表位和9個線性IgG表位，且與TIM存在多個相同抗原表位區(qū)域。
　　在此基礎(chǔ)上，深入探索了克氏原螯蝦TIM與FLN c的相互結(jié)合關(guān)系。采用噬菌體展示技術(shù)，分析發(fā)現(xiàn)與FLN c結(jié)合的TIM位點(diǎn)主要有3個構(gòu)象型結(jié)合位點(diǎn)和3個線性結(jié)合位點(diǎn)，與TIM結(jié)合的FLN c位點(diǎn)主要有8個構(gòu)象型結(jié)合位點(diǎn)和6個線性結(jié)合位點(diǎn)，判定TIM和FLN c存在相互結(jié)合。