克氏原螯蝦致橫紋肌溶解危害物與過敏原的分析.pdf

1、2010年秋季，南京市共收治食用克氏原螯蝦(Procambarus clarkii，crayfish)致橫紋肌溶解的病例23人，國內學者推測該疾病可能與過敏反應或生物毒素有關，但尚未得到確認。此外，蝦類過敏是人類常見的一種過敏性疾病，但目前國內關于克氏原螯蝦過敏原的報道僅見其分子生物學的相關研究。因此，開展關于克氏原螯蝦致橫紋肌溶解危害物與過敏原的分析研究具有重要的現實意義。
　　 蝦類過敏嚴重地影響著消費者的健康，本研究擬純化

2、克氏原螯蝦的過敏原并分析其過敏性。本研究采用甲殼類過敏患者血清的Western-blotting確定克氏原螯蝦的主要過敏原，通過鹽析、等電點沉淀及熱處理等方法純化過敏原并加以鑒定；通過DNAman軟件分析過敏原的序列同源性，PeptideCutter軟件預測其酶切位點；完成過敏原的體外模擬胃、腸液消化，以及不同時間蒸煮處理蝦肉粗提液的模擬胃腸液二相消化，利用Western-blotting和抑制性ELISA分析其消化穩(wěn)定性及免疫活性。結

3、果顯示，克氏原螯蝦中相對分子量36 kDa的蛋白組分與13份甲殼類動物過敏患者血清均發(fā)生特異的免疫雜交反應，與兔抗擬穴青蟹原肌球蛋白(Tropomyosin，TM)多克隆抗體發(fā)生特異性免疫雜交反應，且該蛋白耐熱，等電點約4.5，表明克氏原螯蝦的主要過敏原為TM；克氏原螯蝦TM與南美白對蝦TM、擬穴青蟹TM的氨基酸序列相似性較高(>90%)，有49個胰蛋白酶和6個胰凝乳蛋白酶的酶切位點(酶切幾率>70%)；TM不易被胃蛋白酶降解，易于被胰

4、蛋白酶和胰凝乳蛋白酶降解，但消化產物仍具有一定的免疫活性；蒸煮處理可減弱TM的消化穩(wěn)定性及消化產物免疫活性，且蒸煮處理時間越長，效果越顯著。以上結果表明TM為克氏原螯蝦主要過敏原，與其他甲殼類動物TM序列相似性較高，模擬胃腸液消化產物仍具有一定的免疫活性，蒸煮處理能減弱其消化穩(wěn)定性及免疫活性，但不能完全消除其免疫活性。
　　 克氏原螯蝦致橫紋肌溶解嚴重地威脅著消費者的健康，但其病因至今仍未得到確認。本研究首先采用克氏原螯蝦的肌肉

5、、鰓腸腺體(Gills，Intestines，and Glands，GIG)分別與小鼠的肌漿、肌原纖維在體外孵育；其次，用搗碎的克氏原螯蝦的肌肉、GIG灌胃ICR小鼠，觀察小鼠的癥狀，收集小鼠血清用于臨床化學分析，摘取小鼠組織用于病理學分析；最后，采用溶血實驗和細胞毒性實驗分析克氏原螯蝦肌肉、GIG的甲醇/水粗提物。結果顯示只有GIG鹽溶性、脂溶性粗提物可降解小鼠肌原纖維；GIG灌胃處理能使小鼠出現肌無力，血清(肌酸激酶及乳酸脫氫酶等)

6、和尿液的檢測指標升高，心臟肌肉、胃、脾、骨骼肌等組織出現病變，其中三只小鼠患橫紋肌溶解癥，表現為：癱瘓、血清肌酸激酶水平是對照組的五倍或五倍以上、腎臟和骨骼肌出現病變，說明GIG含有致橫紋肌溶解的危害物；小鼠的血清IgE水平較低，說明小鼠無發(fā)生過敏反應；GIG的甲醇/水粗提物有溶血作用和細胞毒性作用，但其作用不能被哇巴因抑制，說明克氏原螯蝦不含有?？舅?。以上結果表明克氏原螯蝦GIG最有可能會誘發(fā)橫紋肌溶解，且具有個體差異性，與?？舅?/p>