蝦類過敏原的活性分析及其抗原表位的研究.pdf

1、隨著現(xiàn)代社會(huì)的發(fā)展,人們飲食結(jié)構(gòu)的變化,與食物直接相關(guān)的過敏疾病發(fā)病率日益增高,給人們的生命健康造成了巨大威脅。蝦類產(chǎn)品屬于我國(guó)產(chǎn)值比較高的甲殼類海產(chǎn)品,由于味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富,深受消費(fèi)者的喜愛。然而蝦類海產(chǎn)品屬于8大類食物過敏原之一,使許多消費(fèi)者飽受過敏癥狀的困擾。本論文著重對(duì)蝦類過敏原的鑒定和活性消除方法進(jìn)行研究,結(jié)合生物信息學(xué)方法進(jìn)一步分析過敏原的表位區(qū)域及氨基酸組成性質(zhì),并對(duì)表位進(jìn)行空間定位。主要內(nèi)容如下:
　　 1、以

2、刀額新對(duì)蝦為研究對(duì)象,分離和純化了分子量為36kD的主要過敏原蛋白,利用基質(zhì)輔助激光解析電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)其進(jìn)行肽質(zhì)量指紋圖譜鑒定,并對(duì)得到的結(jié)果采用Mascot搜索引擎在NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行搜索。結(jié)果表明刀額新對(duì)蝦主要過敏原為原肌球蛋白,與斑節(jié)對(duì)蝦原肌球蛋白匹配分值最高為268,吻合肽段27條,序列覆蓋率為65％;與其它無(wú)脊椎動(dòng)物如腐食酪螨、衣魚等的原肌球蛋白的序列覆蓋率也很高。這一結(jié)果不僅表明了刀額新對(duì)蝦與其它甲殼類海產(chǎn)品過敏

3、原存在著高度同源性,而且為其與甲殼類及其它無(wú)脊椎動(dòng)物主要過敏原之間存在嚴(yán)重交叉反應(yīng)的現(xiàn)象提供了理論依據(jù)。
　　 2、在鑒定了刀額新對(duì)蝦的主要過敏原之后,進(jìn)一步分析了常見熱加工方式對(duì)其過敏原活性的影響。選取煮、蒸、高壓這三種方法,分別處理刀額新對(duì)蝦不同時(shí)間。通過檢測(cè)總蛋白和主要過敏原含量以及活性的變化,分析對(duì)蝦類過敏原的影響。結(jié)果表明經(jīng)過三種熱處理后,36kD主要過敏原蛋白仍然存在,但其活性有不同程度的下降。在25-35kD區(qū)域出

4、現(xiàn)一條新的免疫活性蛋白,但影響不大,全蛋白的免疫活性仍有不同程度的降低。其中高壓對(duì)活性的降低程度最大,30分鐘時(shí)免疫活性降低了97％。但質(zhì)地剖面分析結(jié)果表明,高壓處理對(duì)蝦肉質(zhì)構(gòu)破壞最大,仍需進(jìn)一步優(yōu)化高壓處理工藝,在降低蝦致敏活性的同時(shí),保持其口感及營(yíng)養(yǎng)。
　　 3、利用生物信息學(xué)方法對(duì)蝦過敏原及其他甲殼類過敏原之間的同源性進(jìn)行分析,并繪制出系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明甲殼類過敏原原肌球蛋白氨基酸序列十分保守,序列之間同源性很高。其中斑

5、節(jié)對(duì)蝦、凡納濱對(duì)蝦過敏原同褐美對(duì)蝦主要過敏原Pen a1的氨基酸序列完全相同。
　　 采用DNAstar、AntheProt等生物信息學(xué)軟件分析Pen a1的二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、溶劑可及性、可塑性、抗原指數(shù)等多個(gè)性質(zhì),間接預(yù)測(cè)線性表位區(qū)域,并結(jié)合2個(gè)在線網(wǎng)站對(duì)表位的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行篩選,得到10個(gè)抗原表位后進(jìn)行表位肽的固相合成。采用競(jìng)爭(zhēng)Dot-blot方法,利用患者血清對(duì)表位肽的活性進(jìn)行初步驗(yàn)證。結(jié)果表明其中8個(gè)表位多肽為主要過敏原表

6、位,其中有兩個(gè)以前未曾有研究者報(bào)道過。對(duì)表位區(qū)域的氨基酸分析中發(fā)現(xiàn)精氨酸(R)、酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、絲氨酸(S)以及谷氨酸(E)這5種氨基酸在表位區(qū)域出現(xiàn)概率很高。
　　 4、以豬原肌球蛋白1c1gC為模板,利用SWISS-MODEL以及CPHmodels中相關(guān)的同源建模功能對(duì)Pen a1的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。采用原子平均勢(shì)能、分子體系動(dòng)力學(xué)分析以及拉氏構(gòu)象圖對(duì)建模結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果表明模擬形成的Pen a1構(gòu)象有較高的

7、穩(wěn)定性和合理性。從構(gòu)象中可以看出,Pen a1空間結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單,沒有復(fù)雜的三、四級(jí)結(jié)構(gòu),二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋為主。從構(gòu)象方面分析,Pen a1單鏈自身形成構(gòu)象型表位的幾率不大,而線性表位在空間中的定位結(jié)果也顯示基本上線性表位全部暴露在外。
　　 5、利用氨基酸突變的方法研究Pen a1表位中的關(guān)鍵氨基酸,選擇Pen a1中peptide6和peptide10這兩條表位肽,將其中的活性氨基酸替代為人或豬原肌球蛋白中相應(yīng)的非活性氨