苦蕎過敏原TBa的定點(diǎn)突變及免疫活性研究.pdf

1、蕎麥作為一種健康保健食品，種子中含有豐富的蛋白，氨基酸，蕓香苷和黃酮醇，具有抗高血壓和血管出血的功效。由于它通?？墒共糠纸佑|或食用的人發(fā)生嚴(yán)重的過敏反應(yīng)，并且臨床癥狀多樣，這就極大的限制了其作為一種新型保健食品和食品添加劑的使用范圍。蕎麥過敏原蛋白分子和其過敏機(jī)制的研究對于蕎麥過敏癥的精確診斷和安全治療至關(guān)重要且刻不容緩。
　　我們先前的工作分離純化得到云南苦蕎中一種分子量大小為24kDa的過敏蛋白(TBa)，經(jīng)過各種免疫活性檢測

2、發(fā)現(xiàn)它是蕎麥中的一種主要過敏原。通過分子克隆，首次得到了TBa的核苷酸序列，并在GenBank進(jìn)行了登陸(登錄號(hào):AY044918)。本研究通過抗原表位軟件預(yù)測，將TBa全長氨基酸序列劃分為六個(gè)表位區(qū)段:E1:27-67，E2:87-137，E12:27-137，E3:120-156，E6:155-191，E36:120-191。經(jīng)檢測，E1與蕎麥過敏癥患者血清結(jié)合能力最強(qiáng)，說明E1可能是其中的主要表位。
　　在NCBI網(wǎng)站上用B

3、LAST軟件對TBa和其他一些已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，TBa中20-160位（主要表位E1的第27-67位）氨基酸區(qū)域?qū)儆赾upin超家族，此區(qū)域是這一家族的特征序列。在此基礎(chǔ)上，使用DNAStar軟件將E1的序列和同源性較高的其他植物種子貯藏蛋白進(jìn)行比對，結(jié)果顯示39，42，47和54的亮氨酸高度保守，并且二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測也表明這幾個(gè)位點(diǎn)的氨基酸處于柔性較好的區(qū)域。
　　進(jìn)一步將E1進(jìn)行定點(diǎn)突變，用精氨酸取代39，42，

4、47，54的亮氨酸和52位的纈氨酸，并分別命名為L39R，L42R，L47R，V52R和L54R。將突變體基因與表達(dá)載體pET-32m連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。Ni2+-NTA親和純化后，SDS-PAGE檢測表明突變體的分子量與E1一致，純度達(dá)到95％以上。采用ELISA和點(diǎn)雜交的方法檢測重組蛋白與過敏癥患者及健康者血清的IgE結(jié)合活性。結(jié)果表明五個(gè)突變體的免疫活性都有所降低，其中L42R，L47R和L54R