蟹類(lèi)過(guò)敏原的研究.pdf

1、食物過(guò)敏是人類(lèi)常見(jiàn)的一種過(guò)敏性疾病，主要由食物中的蛋白質(zhì)引起。主要癥狀有哮喘、蕁麻疹等，嚴(yán)重的甚至?xí)＜暗缴?。雖然國(guó)外已有大量研究證實(shí)原肌球蛋白是甲殼類(lèi)動(dòng)物的主要過(guò)敏原，但是由于物種的不同，以及人種等各方面的差異，對(duì)我國(guó)消費(fèi)者而言，蟹類(lèi)主要過(guò)敏原是否為原肌球蛋白，或者是其他蛋白，仍有待進(jìn)一步研究證實(shí)。 中華絨鰲蟹(Eriocheir sisensis)、鋸緣青蟹(Scylla serrata)和三疣梭子蟹(Portunus tr

2、ituberculatus)等蟹類(lèi)肉味鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，是我國(guó)蟹類(lèi)增養(yǎng)殖的重要對(duì)象，遠(yuǎn)銷(xiāo)日本及東南亞國(guó)家，也是全球的主要經(jīng)濟(jì)蟹類(lèi)。隨著消費(fèi)人群的擴(kuò)大，過(guò)敏人數(shù)越來(lái)越多。但以中華絨鰲蟹、鋸緣青蟹和三疣梭子蟹等為對(duì)象的過(guò)敏原研究尚未見(jiàn)報(bào)道。 據(jù)此，本研究以國(guó)內(nèi)特有的中華絨螯蟹以及產(chǎn)量豐富的鋸緣青蟹、三疣梭子蟹等為研究對(duì)象，從免疫檢測(cè)、分離純化、抗體制備、分子克隆、原核表達(dá)等方面對(duì)蟹類(lèi)的過(guò)敏原進(jìn)行了研究。首次證實(shí)了中華絨螯蟹的主要過(guò)敏原

3、為原肌球蛋白，并對(duì)其進(jìn)行重組表達(dá)，為今后蟹類(lèi)過(guò)敏原的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供了技術(shù)參考。 采用免疫印跡法，利用過(guò)敏患者血清，確定中華絨螯蟹的主要過(guò)敏原為分子量約38 kDa的蛋白，其它8個(gè)次要過(guò)敏蛋白組分(27、45、105 kDa等)也參與了過(guò)敏反應(yīng)。通過(guò)制備丙酮粉、等電點(diǎn)沉淀、硫酸銨沉淀及加熱處理對(duì)分子量為38 kDa的主要過(guò)敏蛋白進(jìn)行了高度純化。該蛋白的pI約為4.5，與蝦的原肌球蛋白Pen a 1性質(zhì)相近。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該蛋白為

4、原肌球蛋白。 通過(guò)免疫新西蘭大白兔，制備了原肌球蛋白的抗血清，采用Protein A Sepharose親和層析柱對(duì)抗體進(jìn)行了純化。該抗血清效價(jià)高，稀釋度達(dá)409600倍。該抗體與甲殼類(lèi)動(dòng)物及軟體動(dòng)物的原肌球蛋白具有較強(qiáng)的免疫交叉反應(yīng)，可以應(yīng)用于后續(xù)的食品過(guò)敏原的檢測(cè)。 通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)方法，分別克隆得到中華絨鰲蟹、鋸緣青蟹和三疣梭子蟹的原肌球蛋白基因序列。測(cè)序結(jié)果表明，三個(gè)基因的序列長(zhǎng)度均為855 bp，編碼284個(gè)氨基

5、酸殘基，三者間氨基酸序列同源性為99.3％，三段序列均已登錄Genbank。三種蟹的原肌球蛋白基因序列與GenBank中其他甲殼類(lèi)動(dòng)物的原肌球蛋白有很高的同源性。與褐對(duì)蝦原肌球蛋白的8個(gè)IgE結(jié)合位點(diǎn)相比，只在第一個(gè)位點(diǎn)中有6個(gè)氨基酸殘基不一致，其他7個(gè)位點(diǎn)均相同。 將中華絨鰲蟹的原肌球蛋白基因與pGEX-4T-3載體連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)得到分子量約為62 kDa的融合表達(dá)蛋白。通過(guò)與甲殼類(lèi)過(guò)敏患者血清