擬穴青蟹過敏原精氨酸激酶的抗原表位分析研究.pdf

1、食物過敏作為食品安全的熱點(diǎn)問題在全球引起了廣泛關(guān)注，甲殼類動(dòng)物是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)公布的八大類過敏食物之一。蟹類等甲殼類水產(chǎn)品味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，是重要的水產(chǎn)資源;但隨著蟹類消費(fèi)量的增加，因食用蟹類而導(dǎo)致過敏的報(bào)道也隨之增多。精氨酸激酶（Arginine kinase，AK）是存在于甲殼類和軟體類動(dòng)物的泛過敏原，對(duì)其抗原表位的全面了解能夠?yàn)殚_發(fā)低致敏食品和甲殼類過敏疾病的診斷治療提供依據(jù)。
　　本文首先從擬穴青蟹（Scyll

2、a paramamosain）肌肉中純化得到AK，通過體外模擬胃液降解AK，降解產(chǎn)物的免疫活性檢測(cè)結(jié)果表明其降解產(chǎn)物仍具有較強(qiáng)的免疫原性;通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）對(duì)AK的胃液消化產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，得到具有IgG/IgE結(jié)合活性的5個(gè)肽段。分別采用天然AK和分段表達(dá)產(chǎn)物rAK1(AA:87-186)、rAK2(AA:172-265)作為抗原建立小鼠過敏模型，

3、以確定AK抗原表位的優(yōu)勢(shì)區(qū)域，結(jié)果顯示天然AK組和rAK1組的小鼠血清特異性IgE、Th2型細(xì)胞因子IL-4和IL-13均顯著升高，表明天然AK和rAK1能夠誘導(dǎo)小鼠過敏反應(yīng)，提示rAK1為AK的抗原表位優(yōu)勢(shì)區(qū)。
　　采用純化AK免疫新西蘭大白兔獲得兔抗擬穴青蟹AK特異性抗血清，通過ProteinA柱層析得到純化的兔抗擬穴青蟹AK IgG，以純化的IgG為靶蛋白對(duì)噬菌體展示隨機(jī)十二肽庫進(jìn)行生物淘選，獲得與抗原特異性結(jié)合的5個(gè)肽段。

4、利用LocaPep軟件分析淘選出的肽段，模擬得到4個(gè)構(gòu)象表位C-AK-1(D3A4K43M1A5T49T44I7)、 C-AK-2(L31K33V35T32E11E18F14S34D37)、C-AK-3(V177G172M173D176Q178T174L181K175L187)和C-AK-4(R202L170Y203E190P205W204L187T206Y145)，以及關(guān)鍵氨基酸依次為D3，K33，T174和W204。
　　根據(jù)

5、噬菌體展示淘選結(jié)果設(shè)計(jì)合成了19個(gè)重疊肽段，利用甲殼類過敏患者血清檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與血清IgG特異識(shí)別結(jié)合的7個(gè)肽段（AA:113-127，127-141，134-148,141-155,204-218，211-225和316-330）和與血清IgE特異識(shí)別結(jié)合的6個(gè)肽段(AA:113-127，127-141，141-155，204-218，211-225和316-330)。進(jìn)一步通過肥大細(xì)胞（RBL-2H3）脫顆粒實(shí)驗(yàn)確定AK的4個(gè)線性表位:

6、L-AK-1(AA:113-127)，L-AK-2（AA:127-141），L-AK-3(AA:141-155)和L-AK-1(AA:204-218)。
　　利用十二烷基磺酸鈉(SDS)、β-巰基乙醇(β-Me)、二硫蘇糖醇(DTT)、尿素和鹽酸胍等變性劑處理天然AK，通過免疫印跡檢測(cè)變性處理后AK的IgE結(jié)合活性變化，結(jié)果表明AK的致敏性依賴于其空間構(gòu)象的完整性，存在于分子內(nèi)部的二硫鍵Cys201-Cys271對(duì)于維持AK的空間