擬穴青蟹HSP70、PDI及GnRH受體的研究.pdf

1、擬穴青蟹Scylla paramamosain(Estampador，1949)是我國東南沿海4種青蟹中的主要優(yōu)勢(shì)種，重要的海洋經(jīng)濟(jì)蟹類之一。本研究采用分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)對(duì)擬穴青蟹的一些功能蛋白—熱休克蛋白70(heat shock protein70，HSP70)、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase，PDI)和促性腺激素釋放激素受體(gonadotropin—releasing hormon

2、e receptor，GnRH—R)進(jìn)行研究，旨在證明這些蛋白在擬穴青蟹體內(nèi)的存在，了解其分子結(jié)構(gòu)和分布，為擬穴青蟹生殖調(diào)控機(jī)制的研究以及水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展提供基礎(chǔ)資料。所涉及的研究內(nèi)容可分為以下兩個(gè)部分： 第一部分?jǐn)M穴青蟹分子伴侶和折疊酶的分子克隆和表達(dá)的研究 運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)分子伴侶中最保守的成員—HSP70以及迄今發(fā)現(xiàn)的兩種折疊酶之一—PDI進(jìn)行研究，結(jié)果如下： 1、獲得擬穴青蟹HSP70和PDI全長cD

3、NA序列 利用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)和基因克隆等分子生物學(xué)技術(shù)，首次在青蟹屬發(fā)現(xiàn)HSP70和PDI，并測(cè)定了擬穴青蟹HSP70和PDI全長cDNA序列，推導(dǎo)出其氨基酸序列，結(jié)果已登錄GeneBank，登錄號(hào)為EU754021和EU679503。 擬穴青蟹HSP70 cDNA序列全長共2，189 bp，包括完整的5’非翻譯區(qū)、開放閱讀框以及3’非翻譯區(qū)。其中開放閱讀框位于111-2，063 bp區(qū)域，共編碼650

4、個(gè)氨基酸，總分子量約為71.2 kDa，理論等電點(diǎn)為5.38。 擬穴青蟹PDI cDNA序列全長2，004 bp，包括完整的5’非翻譯區(qū)、開放閱讀框以及3’非翻譯區(qū)，其中開放閱讀框位于97—1，549 bp區(qū)域，推導(dǎo)出前體肽含有483個(gè)氨基酸，由最前端19個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和余下的464個(gè)氨基酸的成熟肽組成。擬穴青蟹PDI成熟肽總分子量約為51.9 kDa，理論等電點(diǎn)為5.24。 2、擬穴青蟹HSP70和PDI與同源蛋白的

5、比較 擬穴青蟹HSP70序列與果蠅、斑馬魚、非洲爪蟾、家鼠和人的相似性分別為83.1％、82.3％、86.4％、81.1％和81.2％，可見HSP70基因具有很高的遺傳保守性，由HSP70氨基酸序列繪制的甲殼綱分子系統(tǒng)樹基本能夠反映出各物種間進(jìn)化關(guān)系。而PDI基因的遺傳保守性不高，它與果蠅、斑馬魚、非洲爪蟾、家鼠和人的相似率分別為(27.6％、31.0％、28.9％、29.8％和25.8％)，根據(jù)PDI氨基酸序列繪制的節(jié)肢動(dòng)物門

6、分子系統(tǒng)樹不能反映物種間的親緣關(guān)系。 3、HSP70和PDI在擬穴青蟹各組織器官的表達(dá) 運(yùn)用半定量RT-PCR技術(shù)，分別檢測(cè)了發(fā)育期雌性擬穴青蟹的八個(gè)不同組織器官--腦、胸神經(jīng)團(tuán)、眼柄、卵巢、肝胰腺、心臟、肌肉和胃中HSP70和PDI的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。結(jié)果顯示：在這八個(gè)組織器官中均成功擴(kuò)增得到HSP70和PDI預(yù)期產(chǎn)物，說明這兩個(gè)基因可以在擬穴青蟹組成型表達(dá)。其中，HSP70在卵巢中表達(dá)量最高，為β-Actin表達(dá)量的1.

7、86倍，其次為腦，表達(dá)量為β-Actin的1.56倍。在眼柄和肌肉組織中的表達(dá)量最低約為β-Actin基因的一半。PDI亦在卵巢中表達(dá)量最高，為β-Actin表達(dá)量的1.06倍，在胃和眼柄表達(dá)量最低，僅為為β-Actin表達(dá)量的1/5左右。 HSP70和PDI在擬穴青蟹卵巢中以及HSP70在腦中的高表達(dá)量暗示了這兩種蛋白也許與擬穴青蟹的生殖發(fā)育有關(guān)。 第二部分?jǐn)M穴青蟹GnRH-R的初步研究 利用免疫印跡(Wes

8、tern blot)和免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)等技術(shù)研究了擬穴青蟹與外源促性腺激素釋放激素受體的抗體結(jié)合的抗原及其相互作用的蛋白，結(jié)果如下： 1、三種GnRH-R抗體在擬穴青蟹神經(jīng)生殖系統(tǒng)中的Western blot檢測(cè) 用兔抗人、兔抗果蠅和兔抗海鞘的GnRH-R抗體分別對(duì)擬穴青蟹腦、胸神經(jīng)團(tuán)、眼柄和精巢進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果顯示在各組織器官中共有的免疫陽性條帶在分子量4

9、5-55 kDa范圍之間。除眼柄外其它組織器官免疫結(jié)果還有其它免疫陽性條帶的存在：腦和胸神經(jīng)團(tuán)中另有一條36 kDa左右?guī)?；在性腺中的不同抗體免疫結(jié)果有一定的差異，其中兔抗人和果蠅抗體免疫結(jié)果有一條28 kDa左右條帶，而兔抗海鞘抗體免疫結(jié)果顯示性腺中不僅有28 kDa的條帶還有跟腦與胸神經(jīng)團(tuán)一致的約為36 kDa的條帶以及一條30 kDa的條帶。 2、外源GnRH-R抗體對(duì)擬穴青蟹胸神經(jīng)團(tuán)和性腺的免疫共沉淀反應(yīng) 利用免

10、疫共沉淀技術(shù)，分離出擬穴青蟹與外源GnRH-R抗體結(jié)合的兩種抗原，為擬穴青蟹GnRH-R的存在提供證據(jù)。有趣的是這兩種抗原的分子量分別與哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物GnRH-R的分子量大小接近，分別為38.1 kDa和54.0 kDa。同時(shí)還分離出與這兩種蛋白相互作用的八種蛋白。對(duì)這十種蛋白樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析，并與GPS(Applied Biosystems)-MASCOT(Matrix Science)數(shù)據(jù)庫中已有的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，沒有發(fā)現(xiàn)匹配的