擬穴青蟹抗脂多糖因子6的克隆、表達(dá)及活性研究.pdf

1、擬穴青蟹(Scylla Paramamosain)是我國東南沿海地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖蟹。隨著青蟹養(yǎng)殖規(guī)模日漸擴(kuò)大、養(yǎng)殖密度的增高及抗生素的濫用，導(dǎo)致疾病爆發(fā)頻繁，給養(yǎng)殖戶造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失并嚴(yán)重阻礙了養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。目前，由于對擬穴青蟹免疫作用機(jī)制及免疫相關(guān)基因的研究還處于初級階段，對其疾病的防控研究也進(jìn)展緩慢?？怪嗵且蜃樱╝nti-lipopolysaccharide factors,ALFs）是一類在蝦、蟹及軟體動物體內(nèi)廣泛存在

2、，具有廣譜性抗菌效果的小分子多亞型抗菌肽，目前在擬穴青蟹中已報道五種抗脂多糖因子。為了充分探究抗脂多糖因子在青蟹免疫系統(tǒng)中的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制，本論文以擬穴青蟹抗脂多糖因子6(SpALF6)為研究對象，分別從基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)兩個層面對SpALF6的進(jìn)行了研究。獲得結(jié)果如下：
　　1. SpALF6基因克隆、生物信息學(xué)及表達(dá)分析
　　從課題組前期獲得的擬穴青蟹經(jīng)副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）刺激后的

3、轉(zhuǎn)錄組、表達(dá)譜數(shù)據(jù)獲得SpALF6部分序列，利用RACE技術(shù)獲取SpALF6全長序列702bp，預(yù)測開放讀碼框（ORF）408bp,編碼135個氨基酸，在68位和89位有兩個保守的半胱氨酸殘基，構(gòu)成脂多糖結(jié)合區(qū)域。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，SpALF6與三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)抗脂多糖因子6（PtALF6）、擬穴青蟹（S. Paramamosain）抗脂多糖因子2（SpALF2）親緣關(guān)系較近（同源性分別為7

4、7.39％和72.17%）?；蚪M結(jié)構(gòu)分析表明，SpALF6由三個外顯子和兩個內(nèi)含子組成，且脂多糖結(jié)合區(qū)域在第二外顯子上。Real-time PCR分析結(jié)果顯示，SpALF6在血淋巴、肝胰腺、腦、內(nèi)皮、肌肉、中腸、心、鰓中的組織表達(dá)特性，其中在腦組織表達(dá)量最高，其次是內(nèi)皮組織。免疫刺激實(shí)驗(yàn)表明，擬穴青蟹經(jīng)WSSV，PolyI:C脅迫后，除在血淋巴組織中SpALF6呈下調(diào)表達(dá)之外，其余實(shí)驗(yàn)處理組（包括副溶血弧菌、脂多糖刺激）均出現(xiàn)明顯上調(diào)

5、。
　　2.原核表達(dá)及重組蛋白活性檢測
　　構(gòu)建表達(dá)載體pET-32a(+)-ORF并導(dǎo)入大腸桿菌BL21，利用鎳柱親和層析純化重組蛋白rSpALF6。通過抗菌、黏菌活性和最小抑菌濃度（Minimal growth inhibition concentrations，MIC）的檢測，確認(rèn)rSpALF6的生物學(xué)活性。其中rSpALF6對革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus）、革蘭氏陰性菌（大

6、腸桿菌 Escherichia coli、副溶血弧菌 V.parahemolyticus、嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila、溶藻弧菌Vibrio alginolyticus）和真菌（釀酒酵母 Sacchromyces cerevisiae）均有很強(qiáng)的抑制作用。但對乙型鏈球菌（Beta hemolytic Streptococcus）抑制效果不明顯。利用Western blot檢測重組蛋白的黏菌活性，結(jié)果表明rSpAL