擬穴青蟹凋亡抑制蛋白基因的全長cDNA克隆與干露脅迫下表達分析.pdf

1、擬穴青蟹（Scylla paramamosain）是我國東南沿海主要的海水養(yǎng)殖蟹類之一，具有重要的經(jīng)濟價值。隨著人們生活水平的提高，擬穴青蟹無水?；钸\輸變得越來越普遍，但該運輸方式使擬穴青蟹處于一種無水干露狀態(tài)，隨著運輸時間的延長常會導致一定比例的青蟹死亡，造成一定的經(jīng)濟損失。干露會引起失水，導致擬穴青蟹組織缺氧，使細胞處于低氧狀態(tài)，從而引起細胞凋亡，嚴重時會引起細胞死亡。凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis p

2、rotein，IAP)是抑制細胞凋亡的關(guān)鍵基因之一，目前有關(guān)IAP基因在蟹類中尚未見報道。本實驗采用同源克隆策略和RACE技術(shù)在擬穴青蟹中成功克隆得到IAP基因的全長cDNA序列，分析了LAP基因核苷酸序列、氨基酸序列結(jié)構(gòu)，采用實時熒光定量方法檢測分析了IAP基因在擬穴青蟹不同組織中的表達情況，以及干露脅迫下擬穴青蟹肝胰腺中IAP基因的表達量。同時，采用RNA干擾技術(shù)對擬穴青蟹IAP基因進行干擾后，利用流式細胞儀檢測了干露脅迫下擬穴青蟹

3、肝胰腺細胞的凋亡情況。
　　擬穴青蟹IAP基因全長為3351 bp，包括1986 bp的ORF，編碼662個氨基酸，5'-UTR（5'端非編碼區(qū)）為270bp，3'-UTR（3'端非編碼區(qū)）為1095 bp，GenBank的登錄號為KT965726。生物信息學分析表明擬穴青蟹IAP蛋白具有3個BIR結(jié)構(gòu)域和1個RING結(jié)構(gòu)域。Blast分析比對顯示，擬穴青蟹IAP基因與與南美白對蝦（Penaeus monodon）、羅氏沼蝦（Ma

4、crobrachium rosenbergii）和凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）的IAP基因同源性最高，均為49％。NJ進化樹表明擬穴青蟹首先與羅氏沼蝦等甲殼動物聚在一起，且與家蠶等昆蟲親緣關(guān)系較近，聚為一支。
　　經(jīng)實時熒光定量PCR檢測，擬穴青蟹IAP基因在鰓、肝胰腺、肌肉、心、胃、眼柄和血細胞等7個組織中均有表達，且表達量不同。結(jié)果顯示擬穴青蟹IAP基因在肝胰腺中表達量最高，其次為肌肉，在血細胞中表達

5、量最低。擬穴青蟹IAP基因在鰓、胃、心和眼柄中表達量無顯著差異(P＞0.05)。干露6h后肝胰腺中 SpIAP基因的表達開始上升，12h顯著升高(p＜0.05)，到24h達到最高（為初始值的7.5倍），后逐漸減低。
　　RNA干擾結(jié)果顯示，注射siRNA組IAP基因的表達量顯著低于對照組(P＜0.05)，而對照組(空白、注射PBS及注射random-siRNA)相互之間無顯著差異(P＞0.05)。結(jié)果表明注射的siRNA有顯著的干