擬穴青蟹陽離子非依賴6-磷酸甘露糖受體(SpCI-MPR)基因的克隆和功能研究.pdf

1、陽離子非依賴6-磷酸甘露糖受體(cation-independent mannose-6-phosphate receptor,CI-MPR)又稱胰島素樣生長因子 II受體(Insulin-like growth factor-II receptor,IGF2R)，隸屬于P型凝結(jié)素家族，是一種多能細(xì)胞受體。然而，過去對(duì)CI-MPR的研究主要局限于脊椎動(dòng)物，在甲殼動(dòng)物中尚沒有相關(guān)的研究報(bào)道。擬穴青蟹(Scylla paramamosain

2、)是一種典型的甲殼動(dòng)物，廣泛分布于我國的東南沿海等地。近年來，對(duì)擬穴青蟹的研究已取得了一定成果。擬穴青蟹良好的研究背景為研究CI-MPR基因的功能奠定了基礎(chǔ)。本研究以擬穴青蟹CI-MPR(以下稱SpCI-MPR)基因?yàn)檠芯繉?duì)象，主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　1.獲得擬穴青蟹CI-MPR基因的全長序列
　　本研究在已知部分序列的基礎(chǔ)上，利用RACE方法獲得了擬穴青蟹SpCI-MPR基因的cDNA全長序列，序列已上傳至GenBa

3、nk(Accession number：KM658157)。該序列長度為3931bp，編碼1095個(gè)氨基酸。序列分析顯示該基因編碼的蛋白含有7個(gè)保守的“MRH”結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域均含有保守的6-8個(gè)半胱氨酸，該結(jié)構(gòu)為CI-MPR蛋白的特異保守結(jié)構(gòu)域。對(duì)氨基酸序列進(jìn)行BLASTP在進(jìn)行同源性檢索發(fā)現(xiàn)SpCI-MPR蛋白序列與其它動(dòng)物的CI-MPR蛋白序列具有較高的同源性?；贑I-MPR蛋白氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹同物種進(jìn)化關(guān)系保持一致

4、。由此表明已成功克隆到擬穴青蟹SpCI-MPR基因的cDNA全長序列。
　　2.生物信息學(xué)方法對(duì)SpCI-MPR基因進(jìn)行功能和特征分析
　　該蛋白存在大量的糖基化和磷酸化位點(diǎn)。在SpCI-MPR蛋白的7個(gè)結(jié)構(gòu)域中，結(jié)構(gòu)域5和結(jié)構(gòu)域6同哺乳動(dòng)物的結(jié)構(gòu)域3和結(jié)構(gòu)域9擁有較高的同源性，推測(cè)兩個(gè)結(jié)構(gòu)域在磷酸甘露糖(mannose6-phosphate，Man-6-P)結(jié)合時(shí)發(fā)揮著重要的作用。同時(shí)，基于結(jié)構(gòu)比對(duì)的分析發(fā)現(xiàn)，SpCI-M

5、PR蛋白缺少與IGF-II結(jié)構(gòu)位點(diǎn)相關(guān)的疏水基團(tuán)和必須氨基酸，由此推測(cè)擬穴青蟹的SpCI-MPR蛋白不具有調(diào)控IGF-II的功能。
　　3.對(duì)SpCI-MPR基因進(jìn)行時(shí)空表達(dá)分析
　　為研究SpCI-MPR基因?qū)M穴青蟹生長和早期發(fā)育的影響，本文檢測(cè)了其在擬穴青蟹從剛出生后的蚤狀幼體I期(Zoea I,Z1)、蚤狀幼體II期(Zoea II,Z2)、蚤狀幼體III期(Zoea III,Z3)、蚤狀幼體IV期(Zoea IV,

6、Z4)、蚤狀幼體V期(Zoea V，Z5)和大眼幼體(Megalopae,M) SpCI-MPR基因表達(dá)量的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從胚胎到幼體出生后3天內(nèi)其表達(dá)量無顯著變化，此后其表達(dá)量逐漸上升，在Z2達(dá)到最高，然后逐漸下降并趨于平穩(wěn)。同時(shí)，我們還檢測(cè)了該基因在擬穴青蟹肌肉、血液、肝胰腺、胃、腮、睪丸、卵巢、心臟鰓、結(jié)締組織、胸神經(jīng)節(jié)和腦神經(jīng)節(jié)這11個(gè)組織中的表達(dá)分布情況。結(jié)果顯示SpCI-MPR基因的表達(dá)量呈現(xiàn)一定的組織特異性，在肝胰腺、血

7、液和心臟這3個(gè)組織中的表達(dá)量最高，在其他組織中的表達(dá)量較低。上述結(jié)果暗示SpCI-MPR基因可能在擬穴青蟹的生長發(fā)育起著重要的作用。
　　4.擬穴青蟹中SpCI-MPR基因的印跡表達(dá)模式以及與其表達(dá)量之間的關(guān)系
　　對(duì)SpCI-MPR基因的序列分析發(fā)現(xiàn)在5'端含有大量的CpG島序列，為潛在的甲基化位點(diǎn)，提示該基因可能為印跡基因。對(duì)雜合子等位基因的轉(zhuǎn)錄情況分析表明SpCI-MPR基因?yàn)橛≯E基因。組織水平的分析提示SpCI-MP

8、R基因在擬穴青蟹中印跡表達(dá)模式具有組織特異性。同時(shí)結(jié)果顯示SpCI-MPR基因在正常非印跡組織中的表達(dá)量明顯高于印跡組織中的表達(dá)量，SpCI-MPR基因的印跡狀態(tài)與其表達(dá)水平之間具有一定的相關(guān)性。印跡調(diào)控通過改變有效轉(zhuǎn)錄基因的拷貝數(shù)來進(jìn)行調(diào)控表達(dá)對(duì)基因的表達(dá)量進(jìn)行調(diào)控，從而影響生長和發(fā)育等過程。
　　5.載體構(gòu)建了原核表達(dá)載體，獲得重組蛋白
　　此外，我們利用pET-30a(+)載體構(gòu)建了原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌(Esch