捻轉(zhuǎn)血矛線蟲精氨酸激酶的克隆表達及其抗原特性分析.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲屬于圓線目(Strongylata)，毛圓科(Trichostrongylidae)，血矛屬(Haemonchus)，主要寄生在反芻獸的第四胃，偶見于小腸，以吸食宿主動物的血液為生，導(dǎo)致宿主貧血和引發(fā)貧血綜合癥，嚴重的可致動物、特別是幼畜的大批量死亡，致使畜牧養(yǎng)殖業(yè)蒙受巨大損失。目前，主要靠化學(xué)藥物控制捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病，但是化學(xué)藥物的濫用已導(dǎo)致捻轉(zhuǎn)血矛線蟲抗藥蟲株在世界范圍內(nèi)出現(xiàn)，不僅污染環(huán)境，而且殘存化學(xué)藥物的農(nóng)畜產(chǎn)品流入市

2、場也會嚴重影響人類的身體健康。因此尋找符合時代要求的新的防控捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病方法已迫在眉睫。
　　當(dāng)今，對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的免疫學(xué)研究已經(jīng)取得重大進展，但仍無商品化的疫苗上市。因此發(fā)掘新的抗原及深入研究該蟲體抗原的特性對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的防控具有重要意義。本文對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的精氨酸激酶進行基因克隆、表達與純化，并對重組蛋白的酶活性進行分析;研究了該重組蛋白對山羊外周單核細胞各細胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響及對外周血單核細胞的增殖作用;分析

3、了精氨酸激酶在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲雌、雄蟲體內(nèi)的分布情況。
　　1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲精氨酸激酶基因的克隆與表達
　　根據(jù)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲精氨酸激酶(Arginine Kinase，AK)基因序列設(shè)計1對特異性引物，用RT-PCR方法從捻轉(zhuǎn)血矛線蟲總RNA中擴增出約為1104 bp的DNA片段。將該片段克隆到pMD19-T載體后進行序列測定和分析，發(fā)現(xiàn)該基因與GenBank中捻轉(zhuǎn)血矛線蟲AK基因的相似度為99％。將該基因的開放閱讀框克隆到pE

4、T-32a(+)載體中，獲得原核表達質(zhì)粒pET32/AK，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，重組子用IPTG誘導(dǎo)，經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因獲得了表達，重組蛋白分子量大小約為60.3 KD，重組蛋白主要以包涵體形式存在。對該包涵體蛋白變性、純化后，用梯度尿素對其進行連續(xù)透析復(fù)性后，Western blot分析顯示該重組蛋白可被人工感染捻轉(zhuǎn)血矛線蟲山羊的血清所識別。
　　2、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲精氨酸激酶的酶活性測定
　　為了解捻轉(zhuǎn)

5、血矛線蟲精氨酸激酶的催化特性，進而為其成為有效藥物靶標奠定基礎(chǔ)。本實驗采用改進的定磷法對原核表達的重組蛋白進行精氨酸激酶酶活性測定，選用10、20、25、30、35、40、50和60℃8個溫度點和5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0和10.0共8個pH點進行酶的催化反應(yīng)，分光光度計于660nm處測反應(yīng)體系的吸光度，根據(jù)磷含量和酶活性定義計算其酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該重組蛋白具有一定的酶活性，其最佳反應(yīng)溫度和pH分別為30℃

6、和pH7.5。
　　3、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲重組AK蛋白對山羊外周單核細胞細胞因子表達情況的影響
　　用0、10、20、40μg/mL四種不同濃度的重組AK蛋白分別刺激山羊外周血單核細胞，37℃共培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)細胞并提取其總RNA，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測各實驗組中IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、IFN-γ和TGF-β mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，在重組AK濃度為40μg/mL組中IL-17 mRNA轉(zhuǎn)錄水平

7、是對照組(空pET-32a(+)蛋白組）的9.45倍，在20μg/mL組中其為對照組的2.69倍;IFN-γ的mRNA轉(zhuǎn)錄水平在10、20、40μg/mL三個實驗組中分別是對照組的2.20、3.15、4.14倍。而IL-2、IL-4、IL-10和TGF—β變化不顯著。
　　4、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲重組AK蛋白對山羊外周單核細胞的增殖作用
　　為檢測捻轉(zhuǎn)血矛線蟲重組AK蛋白對山羊外周血單核細胞的刺激與增殖作用，將0、10、20、40μ

8、g/mL四個不同濃度的重組蛋白與山羊外周血單核細胞37℃共同培養(yǎng)24 h后，用CCK-8試劑盒檢測其增殖效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組AK在添加濃度為10tg/mL和20μg/mL時增殖效果顯著，其增殖指數(shù)分別為1.68和1.39;而pET-32a(+)空載體蛋白刺激增殖效果不顯著，其增殖指數(shù)為0.95，這說明AK有促進山羊外周血單核細胞增殖的效果。
　　5、精氨酸激酶在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲雌、雄成蟲中的定位
　　為研究捻轉(zhuǎn)血矛線蟲AK在捻轉(zhuǎn)血