捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染性三期幼蟲gst和ubq基因的篩選及抗干燥功能分析.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲寄生于綿羊和山羊的皺胃內(nèi)以吸血為生，是引起宿主致病和造成經(jīng)濟(jì)損失最嚴(yán)重的腸道寄生線蟲種類之一，分布范圍很廣?，F(xiàn)階段對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的防治主要以藥物為主，但蟲體抗藥性的問(wèn)題日益嚴(yán)重。分子疫苗也是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，但由于對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的免疫機(jī)理了解不深，至今還沒(méi)有成功的疫苗上市。目前防治捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的措施主要集中在寄生階段，對(duì)自由生活的幼蟲防控方法較少。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染性三期幼蟲對(duì)干燥脅迫都有很強(qiáng)的適應(yīng)性，此時(shí)常形成休眠狀態(tài)，相關(guān)

2、行為、形態(tài)和生化機(jī)制改變以抵抗極端環(huán)境。目前捻轉(zhuǎn)血矛線蟲L3期幼蟲在干燥脅迫下的生存機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)篩選捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染性三期幼蟲在干燥環(huán)境下的相關(guān)基因，探索其能抵抗外界干燥環(huán)境，成功感染宿主的分子機(jī)制，為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲自由生活階段的防控措施提供思路。
　　本研究分別提取正常培養(yǎng)和50％相對(duì)濕度條件下干燥培養(yǎng)的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染性三期幼蟲mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用銀染mRNA差異基因顯示技術(shù)在干燥和正常培養(yǎng)的銀染聚丙烯酰

3、胺凝膠中回收差異顯示條帶，PCR再擴(kuò)增回收測(cè)序，進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示，篩選獲得58個(gè)差異表達(dá)的EST序列，生物信息學(xué)分析表明其中49個(gè)(84.48％)序列與現(xiàn)有的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲基因組數(shù)據(jù)庫(kù)有高度同源性，18個(gè)(31.03％)與已知線蟲的cDNA或基因組序列有較高同源性，11個(gè)(18.96％)與其它線蟲已知蛋白質(zhì)氨基酸序列同源性較高。差異表達(dá)序列BF-U01A包含泛素(UBQ)家族結(jié)構(gòu)域，與秀麗隱桿線蟲泛素家族氨基酸同源性高達(dá)95％

4、。差異表達(dá)序列GH-U02A與已知捻轉(zhuǎn)血矛線蟲谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)氨基酸同源性為94％。其他差異表達(dá)序列分別與各種線蟲的半胱氨酸蛋白酶，轉(zhuǎn)座酶和與G蛋白偶聯(lián)受體，β轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白重復(fù)和GIY-YIG族核酸內(nèi)切酶等相關(guān)的假定蛋白有關(guān)。
　　為驗(yàn)證銀染mRNA差異顯示技術(shù)篩選出的差異表達(dá)序列，本實(shí)驗(yàn)采用相對(duì)熒光定量PCR分析干燥條件下基因表達(dá)的調(diào)節(jié)趨勢(shì)。結(jié)果表明，Hc-ubq和Hc-gst基因在干燥蟲體中的表達(dá)量較正常蟲體分別上調(diào)

5、了2.1倍和2.2倍，基因表達(dá)上調(diào)極顯著(P＜0.01)。為進(jìn)一步驗(yàn)證Hc-ubq和Hc-gst基因?qū)δ磙D(zhuǎn)血矛線蟲三期幼蟲抗干燥功能的影響，在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲中對(duì)兩基因進(jìn)行RNA干擾，再將捻轉(zhuǎn)血矛線蟲三期幼蟲干燥后再水化復(fù)蘇，結(jié)果顯示ubq基因RNAi組平均存活數(shù)量為154條，平均生存率為77％，與對(duì)照組相比生存率顯著降低(P＜0.05)，gst基因RNAi組平均存活數(shù)量為167條，平均生存率為83.5％，較對(duì)照組顯著降低(P＜0.05)。

6、表明Hc-ubq和Hc-gst基因在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的干燥調(diào)節(jié)中有重要作用。
　　同時(shí)，為驗(yàn)證ubq和gst基因?qū)垢稍锏恼{(diào)控在低濕休眠線蟲種類的抗干燥調(diào)節(jié)中否重要，對(duì)模式生物秀麗隱桿線蟲Ce-gst-7和Ce-ubq-2基因進(jìn)行RNA干擾。結(jié)果顯示，滯育蟲體經(jīng)干燥再水化的過(guò)程后，對(duì)照組在干燥后再水化復(fù)蘇的生存率為86％; gst基因RNAi組生存率為56.5％，較對(duì)照組顯著降低(P＜0.05);ubq基因RNAi組干燥后復(fù)蘇的生存率

7、為67％，較對(duì)照組顯著降低(P＜0.05)。證明gst和ubq基因在線蟲處于干燥狀態(tài)時(shí)，對(duì)蟲體生存的調(diào)控有一定功能。
　　綜上所述，為研究捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染性三期幼蟲抗干燥的相關(guān)分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)銀染mRNA差異顯示法篩選出58個(gè)差異表達(dá)序列，對(duì)其中與已知捻轉(zhuǎn)血矛線蟲谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和秀麗隱桿線蟲泛素家族同源性較高的Hc-gst和Hc-ubq序列通過(guò)相對(duì)熒光定量PCR后結(jié)果表明兩基因在干燥蟲體中的表達(dá)均上調(diào)。在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲中對(duì)