捻轉(zhuǎn)血矛線蟲新基因Hcher-1和HecMSP的克隆與階段性表達(dá)特性分析.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（Haemonchuscontortus）屬毛圓科（Trichostrongylidae）血矛屬（Haemonchus）線蟲，是山羊等反芻動物的主要胃腸道寄生蟲之一，患病動物通常表現(xiàn)為貧血、消瘦甚至死亡，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前的主要防治方法是使用化學(xué)藥物驅(qū)蟲，但隨著抗藥性蟲株的出現(xiàn)，化學(xué)藥品治療正受到嚴(yán)重的挑戰(zhàn)，人們正努力尋求通過免疫學(xué)的方法，代替化學(xué)藥物控制該病。
　　 目前，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲免疫學(xué)方面的研究已取得了重

2、要進(jìn)展，但尚無商品化疫苗用于該病的防控。對該寄生蟲發(fā)育與調(diào)控研究可深入了解其生物學(xué)特性，從而為控制該病提供更多的研究思路。本研究進(jìn)行了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hcher-1和HcMSP基因的克隆和原核表達(dá)，研究了其部分生物學(xué)特性，并對其在各發(fā)育階段的表達(dá)情況進(jìn)行了定量分析，并對其在蟲體發(fā)育過程中的功能做出了預(yù)測。
　　 1.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hcher-1基因的克隆、表達(dá)及免疫原性分析
　　 根據(jù)C.elegans,C.briggsa和B

3、.malayi的her-1基因保守序列設(shè)計(jì)引物，從捻轉(zhuǎn)血矛線蟲cDNA中擴(kuò)增出597bp的DNA片段，經(jīng)克隆測序后以此EST為基礎(chǔ)，利用5'RACE和3'RACE技術(shù)分別獲得該基因的5'端和3'端未知序列，將這些序列拼接后獲得捻轉(zhuǎn)線蟲Hcher-1基因的全長cDNA序列(1091bp)，序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因含有一個960bp的最大開放閱讀框（ORF）、67bp5'非翻譯區(qū)和64bp3'非翻譯區(qū)。根據(jù)此ORF設(shè)計(jì)1對特異性引物，以捻轉(zhuǎn)血矛

4、線蟲的總RNA為模板，采用RT-PCR技術(shù)，擴(kuò)增出960bp的DNA片段，與推導(dǎo)的ORF長度相同。將該片段克隆到pET-28a(+)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosseta，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)融合蛋白在上清和包涵體中均有表達(dá)，分子量約38kDa。以該重組蛋白免疫大鼠制備血清作為一抗，westernblot分析天然HcHER-1蛋白，結(jié)果在約35kDa處出現(xiàn)特異性條帶，與其理論大小一致。
　　 2.捻轉(zhuǎn)

5、血矛線蟲HcMSP基因的克隆、表達(dá)及免疫原性分析
　　 根據(jù)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲雄蟲總蛋白的質(zhì)譜分析結(jié)果和GenBank中秀麗新桿線蟲主要精子蛋白(MSP)核苷酸序列(登錄號為173888)設(shè)計(jì)一對特異性引物，利用RT-PCR技術(shù)獲得捻轉(zhuǎn)血矛線蟲HcMSP基因的表達(dá)序列標(biāo)簽EST。依據(jù)此EST設(shè)計(jì)基因特異性引物，利用5'RACE和3'RACE技術(shù)分別獲得該基因的5'端和3'端未知序列，將這些序列拼接后獲得捻轉(zhuǎn)血矛線蟲HcMSP基因的全長

6、cDNA序列(439bp)。序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因含有一個381bp的最大開放閱讀框(ORF)、17bp5'非翻譯區(qū)和41bp3'非翻譯區(qū)。根據(jù)此ORF設(shè)計(jì)1對特異性引物，以捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的總RNA為模板，采用RT-PCR技術(shù)，擴(kuò)增出381bp的產(chǎn)物。將該片段連接到原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosseta，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE分析表明重組蛋白在上清和包涵體中均有表達(dá)，分子量約為18kDa。以自然感染山羊血清為

7、一抗，westernblot分析未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)條帶，說明捻轉(zhuǎn)血矛線蟲主要精子蛋白可能是一種隱蔽抗原。以該重組蛋白免疫大鼠制備血清為一抗，westernblot分析，天然HcMSP蛋白分子量約為15kDa。
　　 3.Hcher-1和HcMSP基因階段性表達(dá)特性分析
　　 根據(jù)前期工作克隆到的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hcher-1和HcMSP基因全長序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物。SYBRGreenⅠ染料熒光定量法對所設(shè)計(jì)引物的擴(kuò)增效率驗(yàn)證，