捻轉(zhuǎn)血矛線蟲HC58 cDNA基因的分子克隆和功能特性的研究.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲是一種高致病性寄生蟲，可感染綿羊，山羊和牛等反芻動(dòng)物，呈世界性分布，嚴(yán)重影響畜牧業(yè)的發(fā)展。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病(Haemonchosis)是由圓線目(Strongylida)，毛圓科(Trichostrongylidae)，血矛屬(Haemonchus)的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchus contortus)引起的寄生蟲病。每年為控制該病和其他的線蟲病全球估計(jì)要花費(fèi)20億美元.對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病傳統(tǒng)的防治方法是使用化學(xué)驅(qū)蟲藥和對草

2、原的管理，但隨著抗藥蟲株的出現(xiàn)和蔓延、嚴(yán)重的藥物殘留和環(huán)境污染問題，傳統(tǒng)的化學(xué)防治方法受到了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。研制安全、有效的疫苗是防治反芻動(dòng)物捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病亟待解決的問題，已經(jīng)有一些疫苗如：組織蛋白酶B(CBL)半胱氨酸蛋白酶顯示出對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲具有保護(hù)性。 HC58是捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的序列表達(dá)標(biāo)簽，它的部分序列表明它可能是組織蛋白酶B(CBL)半胱氨酸蛋白酶，但與已知的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲組織蛋白酶B有明顯的不同。本論文描述了HC58 cDN

3、A基因全長的克隆和序列分析，原核表達(dá)以及重組HC58蛋白的生物學(xué)功能特性分析；并檢測了用HC58 DNA疫苗免疫山羊后山羊的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。研究工作如下： 1. 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲HC58 cDNA基因的克隆和序列分析根據(jù)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲HC58序列表達(dá)標(biāo)簽(GenBank登錄號為AF305964)設(shè)計(jì)5個(gè)基因特異性引物，利用3’-RACE和5’-RACE分別獲得該基因的3’端未知區(qū)(495bp)和5’端未知區(qū)(430bp)；從而拼接

4、得到HC58的全長cDNA.從捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲中提取總RNA，以此為模版進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。使用瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒純化3′和5′端產(chǎn)物，并克隆到pMD-18T載體，將重組的pMD-18T/3′或5′末端產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化DH<,5a>大腸桿菌，用XbaⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶對重組的pMD-18T/3′或5′末端質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，最后通過測序發(fā)現(xiàn)所克隆的3′和5′端插入序列與GenBank(ace.no.AF305964)申捻轉(zhuǎn)血矛線蟲H

5、C58 EST序列相同，證實(shí)所克隆的3′和5′端序列正確。 使用SEQ EDIT程序?qū)?′和3′端的序列進(jìn)行拼接得到HC58cDNA全長序列，全長序列為851bp的HC58cDNA基因擁有著654bp的開放閱讀框編碼217個(gè)氨基酸，此蛋白的等電點(diǎn)為8.431，預(yù)測其理論分子量為24,332.70Da。此蛋白歸屬為AC半胱氨酸蛋白酶家族成員。 2.HC58 cDNA在大腸桿菌中的表達(dá)和其天然產(chǎn)物的確認(rèn)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲HC58eDNA被

6、克隆到pET-28a原核表達(dá)載體，重組的pET-28a/HC58eDNA被轉(zhuǎn)化到BL<,21>大腸桿菌中，使用1mM IPTG誘導(dǎo)HC58cDNA的表達(dá)，37℃培養(yǎng)4h后，收集細(xì)菌，用SDS-PAGE分析表達(dá)的蛋白，表達(dá)產(chǎn)物為29kDa。重組蛋白以包涵體的方式存在，8Mol/L尿素溶解包涵體，降低尿素的濃度連續(xù)透析。使用鼠抗重組HC58血清做Western blot分析檢測捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的天然蛋白，結(jié)果顯示了一條32kDa的蛋白代替了預(yù)測

7、的24kDa分子量的蛋白。此結(jié)果暗示天然的HC58蛋白是糖基化的蛋白，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲表面膜蛋白抽提物(P2)與鼠抗重組HC58血清在32kDa強(qiáng)烈的反應(yīng)表明HC58天然產(chǎn)物是表面膜蛋白.重組的HC58蛋白與感染捻轉(zhuǎn)血矛線蟲山羊的血清反應(yīng)說明捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染后分泌了HC58蛋白，誘導(dǎo)了山羊抗體反應(yīng)。 3.重組HC58蛋白的血球凝集活性采用人的AB、A、B、O型紅細(xì)胞和山羊、狗、兔、雞、鼠和水牛的紅細(xì)胞懸液分別檢測了重組HC58蛋白的

8、血凝活性.結(jié)果表明，重組HC58蛋白具有血型專一性，在400μg/ml和1.6mg/ml濃度下，對人的AB、A、B和O型紅細(xì)胞以及犬、兔、鼠和水牛的紅細(xì)胞具有較高的凝集活性，對雞的紅細(xì)胞具有較低的凝集活性；在80μg/ml濃度下，對山羊和雞的紅細(xì)胞不發(fā)生凝集作用；即使重組蛋白在1.6mg/ml濃度下也不凝集捻轉(zhuǎn)血矛線蟲天然宿主山羊的紅細(xì)胞。此結(jié)果說明HC58蛋白可能在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的生存中起到重要作用。 4.重組HC58蛋白的半胱

9、氨酸蛋白酶活性在體外，在不同的pH值條件下檢測重組HC58蛋白的半胱氨酸蛋白酶活性，證實(shí)該蛋白具有半胱氨酸蛋白酶家族的特性并能水解Z-FR-AMC和Z-RR-AMC的合成肽底物。在酸性條件下，重組HC58蛋白可顯著降解山羊的血紅素、免疫球蛋白G和azocasein.相反，在堿性條件下，重組HC58蛋白可降解纖維蛋白素原。半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64存在條件下，重組HC58蛋白的這些活性可被明顯地抑制。在體外重組HC58蛋白降解血色素與該

10、蛋白在體內(nèi)公認(rèn)的活性相符。這些結(jié)果暗示HC58蛋白在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的食血過程中可能起到重要作用。 5.HC58 DNA疫苗的免疫保護(hù)性研究鑒于在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲體內(nèi)的生理功能，半胱氨酸蛋白酶是一個(gè)有望控制此病有潛力的候選抗原，但對山羊是否具有免疫保護(hù)力還未見有資料報(bào)道。在這一章里，我們用HC58 DNA苗在山羊上做了免疫保護(hù)性試驗(yàn)。16只山羊被分成4組，每組4只，在攻蟲前的28天和14天用HC58 DNA疫苗免疫兩次，二免后的14天，

11、每只山羊感染5，000條三期感染性幼蟲。結(jié)果顯示，在一免和二免后的7天和10天，HC58 DNA疫苗在注射部位的肌肉中進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。攻蟲后，第一組(HC58DNA組)的每克糞便蟲卵數(shù)(epg)、蟲卵孵化率和皺胃荷蟲數(shù)比對照組分別減少28.02％、47.6％和28.3％；第二組(重組HC58蛋白免疫組)比對照組分別減少26.36％，31.6％和16.1％(P<0.05)。其中，第一、二組的皺胃荷蟲數(shù)(532.25±143.54和622

12、.5±71.29)顯著地低于第四組(未免疫陽性對照組)的皺胃荷蟲數(shù)(741.5-4-241.45)(P<0.05)。攻蟲后，免疫山羊血清IgG、IgA和胃粘膜IgA水平顯著升高，說明HC58 DNA疫苗有較好的免疫保護(hù)效果。 6.HC58 DNA疫苗免疫山羊后的細(xì)胞免疫反應(yīng)DNA疫苗在山羊的免疫保護(hù)性試驗(yàn)中取得了顯著的保護(hù)率，但其免疫的機(jī)理還不清楚。在這一章里，我們檢測了HC58 DNA疫苗免疫山羊后以及攻蟲后的細(xì)胞免疫反應(yīng)。攻蟲后，免