蛋白酶體β5亞基調(diào)節(jié)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲生長發(fā)育的功能研究.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（Haemonchus contortus）是一種寄生在牛、羊等反芻動物胃腸道內(nèi)以吸食血液為生的寄生性線蟲，可以造成被感染的宿主貧血、營養(yǎng)不良甚至死亡。隨著寄生線蟲抗藥性的不斷增加，尋找有效的解決方法迫在眉睫。而蟲體繁殖迅速及生長發(fā)育過程中適應(yīng)性強(qiáng)是捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病流行的主要原因，因此對于捻轉(zhuǎn)血矛線蟲生殖等過程相關(guān)的基因的研究，能夠為開發(fā)有效的新型疫苗以及尋找藥物靶標(biāo)提供理論基礎(chǔ)。
　　真核生物細(xì)胞內(nèi)的26S蛋白酶體在正

2、常情況下可以降解多種蛋白質(zhì)，對于調(diào)節(jié)細(xì)胞周期以及細(xì)胞的存活與凋亡具有重要的作用。26S蛋白酶體主要由20S中心粒子和19S調(diào)節(jié)粒子兩部分構(gòu)成，且在中心粒子上具有六個活性位點(diǎn)，其中兩個活性位點(diǎn)位于β5亞基上，具有胰凝乳蛋白酶樣活性，該活性位點(diǎn)能夠切割疏水性氨基酸殘基，是蛋白酶體活性的主要組成。所有具有催化活性的亞基必須與其相鄰亞基共同合作才能與底物相結(jié)合繼而發(fā)揮水解作用，可見蛋白酶體的完整性對于其發(fā)揮正常功能至關(guān)重要。在寄生原蟲中，蛋白酶

3、體功能的研究已經(jīng)取得了一定的成果，但是在蠕蟲中的研究時至今日仍有待進(jìn)一步研究。據(jù)研究報道β5亞基是決定20S蛋白酶體總體水解活性水平的限速因子。因此在本研究中，探索了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲中的蛋白酶體β5亞基的結(jié)構(gòu)和功能。在釀酒酵母、人類以及絳蟲中，抗癌藥物硼替佐咪(BTZ)可以通過其硼酸基團(tuán)與蛋白酶體β5亞基特定的氨基酸位點(diǎn)結(jié)合而抑制胰凝乳蛋白酶活性，通過將Hc-PBS-5氨基酸序列與具有BTZ結(jié)合位點(diǎn)的物種（已報道）的同源氨基酸序列進(jìn)行比對后

4、，在Hc-PBS-5氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)了抑制劑的結(jié)合位點(diǎn)以及酶活性位點(diǎn)。并且通過體外胰凝乳蛋白酶活性實(shí)驗得出硼替佐咪能夠成功抑制Hc-PBS-5的活性。利用抑制劑硼替佐咪分析Hc-PBS-5在蟲體細(xì)胞進(jìn)程及發(fā)育過程的作用，并結(jié)合RNA干擾技術(shù)研究β5亞基編碼基因Hc-pbs-5在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲生長發(fā)育過程中發(fā)揮的重要功能。研究結(jié)果如下:
　　(1)Hc-PBS-5氨基酸序列的分析
　　通過使用生物信息學(xué)方法分析Hc-PBS-5氨

5、基酸序列表明，Hc-PBS-5氨基酸序列與多種線蟲PBS-5蛋白氨基酸序列ClustalX比對后發(fā)現(xiàn)其具有高度保守的序列。并且在保守序列中發(fā)現(xiàn)Ntn（即N端具有親核類氨基酸）蛋白水解酶亞家族的特征序列、金屬結(jié)合位點(diǎn)、抑制劑結(jié)合位點(diǎn)以及胰凝乳蛋白酶活性位點(diǎn)。且氨基酸序列的末端親水性強(qiáng)，疏水性弱，呈親水性。另外，使用同源建模軟件SWISS-MODEL獲得Hc-PBS-5具有酷似“三明治”樣的三級結(jié)構(gòu)。亞細(xì)胞定位的結(jié)果顯示Hc-PBS-5主要

6、定位在細(xì)胞核，是一種胞內(nèi)蛋白酶。在其氨基酸序列中也未發(fā)現(xiàn)潛在的信號肽以及跨膜區(qū)，所以認(rèn)為Hc-PBS-5既不是膜上的受體也不是分泌型蛋白。
　　(2)Hc-PBS-5在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲中的定位
　　在大腸桿菌中表達(dá)pE-SUMO-Hc-PBS-5重組蛋白，免疫家兔獲得多克隆抗體，利用免疫熒光技術(shù)定位蛋白的表達(dá)位置。發(fā)現(xiàn)蛋白主要表達(dá)在蟲卵以及雌雄蟲前后端腸道以及生殖器官和組織中。
　　(3)硼替佐咪體外抑制實(shí)驗
　　使

7、用脫鞘的三期幼蟲的蛋白提取物進(jìn)行蛋白酶體胰凝乳蛋白酶活性實(shí)驗可知硼替佐咪對于捻轉(zhuǎn)血矛線蟲胰凝乳蛋白酶活性具有高效的抑制性，IC50值可達(dá)0.6μM。使用BTZ對脫鞘的三期幼蟲進(jìn)行體外抑制實(shí)驗，經(jīng)過7d的培養(yǎng)，xL3期幼蟲向L4期幼蟲發(fā)育的發(fā)育率與對照組比較明顯降低。使用BTZ對蟲卵進(jìn)行體外抑制實(shí)驗，在高濃度抑制劑實(shí)驗組中，蟲卵的孵化率與對照組比較降低明顯，低濃度抑制劑實(shí)驗組中，蟲卵的孵化速率與對照組比較相對減慢，但最終的孵化率沒有顯著性

8、差異，經(jīng)過7d的培養(yǎng)后，實(shí)驗組中幼蟲的存活率較對照組明顯降低并且在顯微鏡下觀察到抑制劑實(shí)驗組中存在比正常蟲體短且粗的發(fā)育不良蟲體。
　　(4)Hc-pbs-5基因的干擾實(shí)驗
　　向培養(yǎng)基中添加dsRNA浸泡脫鞘的三期幼蟲，通過熒光定量檢測Hc-pbs-5基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生明顯的下調(diào)。從蟲體接觸dsRNA開始浸泡24h，靶基因被有效的抑制。幼蟲經(jīng)過培養(yǎng)7d后，蟲體活力明顯下降（未統(tǒng)計），脫鞘的三期幼蟲向四期幼蟲的發(fā)育的發(fā)育率比