捻轉(zhuǎn)血矛線蟲基因Hc38保守結(jié)構(gòu)域所在部分的克隆、表達及免疫保護性試驗.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchus contortus)是毛圓科(Trachostrongylidae)血矛屬(Haemonchus)消化道線蟲,感染牛、綿羊、山羊及其他反芻動物,引起動物貧血及貧血綜合癥,嚴重的可致動物,特別是羔羊大批死亡,給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來巨大經(jīng)濟損失。目前,主要采用化學藥物治療該病,但藥物殘留嚴重,加之抗藥性蟲株的出現(xiàn)和蔓延,使得化學治療方法受到了嚴重挑戰(zhàn)。應用免疫學方法防治該病十分迫切和必要。 Hc38基因

2、在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲腸上皮微絨毛內(nèi)高豐度表達,據(jù)推測它的表達產(chǎn)物是一種重要的功能蛋白,與其吸血和免疫逃避機制有關(guān)。該基因表達產(chǎn)物的196-512位氨基酸構(gòu)成的保守結(jié)構(gòu)域?qū)儆诠δ芪粗牡鞍准易錺f04910,該家族目前有71條蛋白序列登錄在GeneBank上,它們分屬于45種生物,其中的14種為人類或動物的重大血源性疫病病原或傳播媒介。GenBank中注冊了該抗原基因的全序列,然而他的功能國內(nèi)尚無相關(guān)資料報道。為此,作者開展了以下研究：

3、 1.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc38保守結(jié)構(gòu)域部分基因的克隆、鑒定及分析 根據(jù)GenBank發(fā)表的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc38基因序列,設(shè)計1對引物。以綿羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲雌性成蟲總RNA為模板,采用RT-PCR技術(shù),擴增出大小約為429bp的產(chǎn)物,回收目的片段并克隆入pMD 19-T載體,通過限制性內(nèi)切酶NcoI和EcoRI雙酶切、PCR、序列測定等方法對重組子進行鑒定：測序結(jié)果與GenBank中AY749124序列同源性為99％。 2.捻

4、轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc38保守結(jié)構(gòu)域部分基因的原核表達及重組蛋白特異性分析 將Hc38保守結(jié)構(gòu)域部分所在基因亞克隆到原核表達載體pPROEXHTa,雙酶切和PCR鑒定篩選出陽性重組質(zhì)粒。IPTG誘導后,SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)重組Hc38保守結(jié)構(gòu)域蛋白在DH5a中表達,且以包涵體形式存在。重組蛋白變性、復性、純化后,通過Western blot測定具有免疫特異性。 3.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲重組Hc38保守結(jié)構(gòu)域部分基因抗原綿羊免疫保護性