纖維素酶基因枯草芽孢桿菌工程菌的構(gòu)建及其酶學性質(zhì)的初步研究.pdf

1、纖維素酶是一類能夠?qū)⒗w維素降解為葡萄糖的多組分酶系的總稱，通過協(xié)同作用，將纖維素降解為寡糖和纖維二糖，最終水解為葡萄糖。纖維素酶在畜禽飼料和環(huán)境處理上發(fā)揮著重要的作用。在飼料中加入適量的纖維素酶可將纖維素最終分解為單糖葡萄糖，有利于被畜禽吸收和轉(zhuǎn)化。纖維素酶還可將農(nóng)作物秸稈和糞污中的纖維素分解成葡萄糖，在緩解環(huán)境壓力的同時又可以產(chǎn)生大量的有機肥料。
　　 本研究擬選取黑曲霉素(An)葡糖苷酶基因BglI、扣囊復(fù)膜孢酵母(Sf)葡

2、糖苷酶基因BglI、綠色木霉(Tv)內(nèi)切葡聚糖酶基因EgVII和帶有信號肽的綠色木霉(Tv)內(nèi)切葡聚糖酶基因EgVII-S作為目的基因轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌，以期獲得具有高效纖維素酶基因的枯草芽孢桿菌工程菌。
　　 主要研究如下:
　　 1.以An-BglI-20T、Sf-BglI-18T、Tv-EgVII-18T、Tv-EgVII-S-18T和大腸-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒pMA5載體為基礎(chǔ)，構(gòu)建了重組質(zhì)粒Sf-BglI-pMA

3、5、An-BglI-pMA5、Tv-EgVII-pMA5、Tv-EgVII-S-pMA5。
　　 2.將An-BglI-pMA5、Tv-EgVII-pMA5、Tv-EgVII-S-pMA5三個質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌(Bs)168，得到的三株工程菌分別為:Bs168-An-BglI-pMA5、Bs168-Tv-EgVII-pMA5、Bs168-Tv-EgVII-S-pMA5。
　　 3.通過剛果紅染色和SDS-PA

4、GE分析，結(jié)果顯示:Bs168-An-BglI-pMA5和Bs168-Tv-EgVII-pMA5在枯草芽孢桿菌中均得到了很好的表達;蛋白大小分別為90.3kDa和26.8kDa，結(jié)合網(wǎng)站預(yù)測與相關(guān)文獻報道是正確;但Bs168-Tv-EgVII-S-pMA5，沒有得到表達或者表達量很低。
　　 4.采用whatman No.1濾紙對纖維素酶工程菌進行濾紙酶活力(FPA)的測定，結(jié)果顯示Bs168-Tv-EgVII-pMA5的胞外上

5、清液中的酶活力為0.273U/mL，Bs168-An-BglI-pMA5的胞外上清液中酶的活力為0.049U/mL。對Bs168-Tv-EgVII-pMA5進行CMC-Na的酶活測定得出的酶活力是0.131U/mL。而Bs168在濾紙試驗中，酶活測定是0.002U/mL，用CMC-Na和pNPG幾乎檢測不到任何酶活力。
　　 5.工程菌培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果表明，Bs168-Tv-EgVII-pMA5分泌纖維素酶作用的適宜pH范圍為5

6、-7，最適pH為5.6，適宜溫度范圍為35-70℃，最適溫度為60℃，在適宜的溫度和適宜pH范圍內(nèi)，此內(nèi)切酶酶活保持最高酶活的65％以上。Bs168-An-BglI-pMA5分泌纖維素酶作用的適宜pH范圍為5-7，最適為pH為5，適宜溫度范圍為50-80℃，最適溫度為70℃，在適宜的溫度和適宜pH范圍內(nèi)，此葡萄糖苷酶酶活可以保持在最高酶活的70％以上。
　　 因此，對構(gòu)建的葡聚糖酶基因工程菌Bs168-An-BglI-pMA5和