組成型纖維素酶高產(chǎn)菌的選育及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、纖維素是自然界中年產(chǎn)量最大的可再生能源，將其充分利用對(duì)于解決人類社會(huì)的環(huán)境污染和日益嚴(yán)峻的能源危機(jī)有著重大的現(xiàn)實(shí)意義。利用纖維素酶來催化水解木質(zhì)纖維素具有反應(yīng)條件溫和、無副產(chǎn)物和污染少等優(yōu)點(diǎn)，但存在生物質(zhì)水解速度慢，酶用量大等缺點(diǎn)。因此開發(fā)新型高效的纖維素酶具有重要的意義。
　　 本研究內(nèi)容主要包括：(1)篩選組成型纖維素酶高產(chǎn)菌株并對(duì)產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化；考察不同碳源及誘導(dǎo)物的影響，初步確定酶系組成；(2)纖維素酶的純化及性質(zhì)研究

2、。
　　 本研究從富含纖維素的土樣中篩選得到一株組成型纖維素酶產(chǎn)生菌LC-9，結(jié)合Biolog微生物自動(dòng)鑒定儀和16S rDNA序列分析，該菌株鑒定為Bacillussubtilis。通過發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化，確定菌株B.subtilis LC-9最佳生長和產(chǎn)酶溫度均為35℃，培養(yǎng)基最適初始pH為5.0～5.5；搖瓶裝液量為50 mL/250 mL，轉(zhuǎn)速為200 r/min。優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基最佳成分為(g/L)：KH2PO43.0，

3、MgSO4·7H2O0.3，蔗糖5.0，蛋白胨15.0，玉米漿30 mL/L。經(jīng)30 h～35 h培養(yǎng)后內(nèi)切纖維素酶活力可達(dá)6.22 IU/mL，比優(yōu)化前提高了40倍。該菌株產(chǎn)酶發(fā)酵周期短，無需纖維素類物質(zhì)的誘導(dǎo)，推測為一株新型高效組成型纖維素酶高產(chǎn)菌株。
　　 各種碳源對(duì)B.subtilis LC-9發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的影響表明，可溶性碳源對(duì)該菌株所產(chǎn)的各種纖維素酶均有一定促進(jìn)作用，乳糖能顯著促進(jìn)內(nèi)切纖維素酶和濾紙酶活力，纖維二糖

4、在發(fā)酵早期可明顯促進(jìn)木聚糖酶活力，推測菌株LC中可能主要存在兩種纖維素酶的成分：β-1，4-內(nèi)切纖維素酶和木聚糖酶。
　　 從B.subtilis LC-9發(fā)酵液中提取分離β-1，4-內(nèi)切纖維素酶。發(fā)酵上清液經(jīng)過不同pH緩沖作為流動(dòng)相的兩步DEAE-Sepharose FF弱陰離子交換，獲得了電泳純的蛋白酶，該酶亞基分子量29 KDa。純酶比活力達(dá)1650.67 IU/mg，純化倍數(shù)為542.98，回收率為61.91％。該內(nèi)切纖

5、維素酶催化羧甲基纖維素鈉水解反應(yīng)符合米氏方程規(guī)律，該酶底物專一催化能力較強(qiáng)，米氏常數(shù)Km為0.0423 g/L，Vmax為135.85 mg/min。
　　 B.subtilis LC-9的β-1，4-內(nèi)切纖維素酶具有良好的pH穩(wěn)定性。在較寬的pH范圍(pH4.0～11.0)內(nèi)均維持較高活力，最適反應(yīng)pH為5.0，最適反應(yīng)溫度為65℃，25℃以下保存酶活基本保持不變。不同濃度的Cu2+、Co2+均可促進(jìn)該內(nèi)切纖維素酶活力，中、低