BART的表達(dá)、純化、多抗制備及其功能初探.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)，BART 與N型鈣離子通道可能存在相互作用，進(jìn)一步的體外共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)顯示，BART和鈣離子通道分子在海馬神經(jīng)元內(nèi)有共定位現(xiàn)象。為進(jìn)一步研究BART的功能及其與鈣離子通道的相互作用及其機(jī)制，首先需要獲得BART 抗體和鈣離子通道抗體。 但是由于商品化的雞抗BART 抗體的二抗為兔抗雞，在進(jìn)行BART和鈣離子通道免疫雙標(biāo)時(shí)，可能與商品化的兔抗鈣離子通道抗體存在交叉反應(yīng)，所以我們采用在大腸桿菌系統(tǒng)中

2、表達(dá)全長(zhǎng)BART 分子作為免疫原，制備小鼠抗人BART的多克隆抗體，用以解決這一難題。 方法：1）采用pET-28a(+)表達(dá)載體，通過(guò)PCR 方法從人源cDNA庫(kù)中擴(kuò)增出全長(zhǎng)BART 基因，構(gòu)建成pET-28a(+)-BART 質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化至BL21 大腸桿菌，并通過(guò)篩選、鑒定和測(cè)序驗(yàn)證；2）IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)含6 個(gè)組氨酸（6xHIS）的BART 融合蛋白，采用變性的方法裂解細(xì)菌，通過(guò)鎳樹(shù)脂（Ni-NTA）親和層析純化系統(tǒng)

3、得到純化的BART 融合蛋白，并經(jīng)Western-blot 驗(yàn)證；3）將純化的融合蛋白與弗氏佐劑充分乳化后免疫BALA/c小鼠（6 ～8周），獲得小鼠抗BART 多克隆抗體，通過(guò)Western-blot 驗(yàn)證該抗體的特異性；4）采用免疫組化方法，檢測(cè)BART分子在海馬神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)格局以及BART 與鈣離子通道在海馬神經(jīng)元和皮層神經(jīng)元中的共定位。 結(jié)果：1）獲得了人源性BART 基因工程菌克隆，該克隆可表達(dá)6xHI

4、S-BART 融合蛋白；2）獲得了純化的6xHIS-BART 融合蛋白,該蛋白具有良好的免疫原性；3）用BART 融合蛋白免疫BALA/c小鼠，獲得了小鼠抗人BART 多克隆抗體，效價(jià)達(dá)1:10,000以上，該抗體能與大鼠脊髓勻漿中的BART 蛋白特異結(jié)合；4）免疫組化染色結(jié)果顯示，BART 分子在海馬神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中廣泛表達(dá)；在海馬神經(jīng)元和皮層神經(jīng)元中，BART 與鈣離子通道存在共定位現(xiàn)象。 結(jié)論：經(jīng)基因工程誘導(dǎo)表達(dá)的B