hOP-1基因的克隆、多抗制備及其在真核細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文hOP-1基因的克隆、多抗制備及其在真核細(xì)胞中的表達(dá)姓名：岳玲申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：口腔醫(yī)學(xué)(口內(nèi))指導(dǎo)教師：史俊南;文玲英2000.5.1第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文中文摘要成骨蛋白．1 ( O s t e o g e n i c P r o t e i n 一1 ，O P —I ) 又稱骨形成蛋白，7 ( B o n eM o r p h o g e n e t i cP r o t e i n ，B M P

2、一7 ) 。最早由O z k a y n a I ( 發(fā)現(xiàn)，并于1 9 9 0 年將其基因克隆成功。隨后對它的蛋白組成、生物學(xué)作用等有了深入的認(rèn)識。O P ．1 屬T G F ．B 超家族，與T G F ．t 3 家族成員有很高的同源性。人的O P ．1基因位于第2 0 號染色體上，其全長c D N A1 8 7 8 b p ，開放讀框1 2 9 6 b p ，編碼4 3 1 個氨基酸，由N 端的信號肽、中間的前肽和C 端的成熟肽構(gòu)成。

3、成熟而具有活性的O P ．1 ，以二聚體糖蛋白形式存在。O P ．1 除具有B M P家族成員所特有的骨誘導(dǎo)功能外，還與牙齒發(fā)育，牙體、牙周組織的修復(fù)和礦化，造血系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)等許多重要的生理功能有關(guān)。然而，由于天然來源的O P 一1 數(shù)量有限，對其功能研究及應(yīng)用都受到了極大的限制，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，使大規(guī)模生產(chǎn)具有活性的O P ．1 重組蛋白質(zhì)成為可能。} ?> —一一為了拓寬O P 一1 的研究與應(yīng)用，通過基因工程技術(shù)

4、，獲得具有生物學(xué)活性的O P ．1 蛋白質(zhì)，探討其在牙齒發(fā)育、礦化中的作用機(jī)制，以及作為一種新的牙髓、牙周病治療材料用于臨床，促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)的形成和牙周組織再生等。本課題主要進(jìn)行了以下幾方面的研究：一．O P —I 成熟肽基因的克隆及多克隆抗體制備：( 本實(shí)驗(yàn)首先利用R T —P C R 技術(shù)，從培養(yǎng)的人牙乳頭細(xì)胞中，克隆出人O P ．1 成熟肽段基因，并在p E H 4 原核表達(dá)載體中獲得高表達(dá)，表達(dá)量占菌體總蛋白的3 3 ％左右。

5、將表達(dá)蛋白初步純化，免疫新西蘭大白兔，獲得了兔抗人O P ．1 多克隆抗血清，效價為1 ：1 0 0 0 0 0 ，為真核系統(tǒng)表達(dá)產(chǎn)物的免疫學(xué)檢測及其o P ．I 的表達(dá)和功能研究創(chuàng)造了條件。廣L 一一二．O P —l 全長基因克隆及C H O 細(xì)胞轉(zhuǎn)染if 在o P ．1 原核表達(dá)并制備多克隆抗血清的基礎(chǔ)上，進(jìn)行o P —l 真核系統(tǒng)表達(dá)研究。通過獲得的人牙乳頭細(xì)胞總R N A ，首次采用擴(kuò)增高G C 含量基因的P C R 試劑盒，得