NR1-TFR重組表位疫苗的制備及其在真核細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、目的:N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-Methyl-D-Asparate Receptor,NR)廣泛參與應(yīng)激、腦損傷、藥物成癮、疼痛等病理生理過程。選擇性阻斷NR活性可能成為相關(guān)疾病的治療手段?，F(xiàn)有的NR拮抗劑或阻斷劑均為人工合成的小分子藥物,由于作用選擇性低常引起幻覺、焦慮不安、意識模糊等嚴(yán)重毒副作用,并存在難以超早期用藥的問題。NR1是NR的功能亞單位,具有NR1的一切電生理學(xué)特性和藥理學(xué)活性。NR1口服疫苗可能是超早期調(diào)控機(jī)體應(yīng)

2、激、防止腦損傷、減緩藥物成癮和治療疼痛等的可行方法之一。但需要有載體攜帶進(jìn)入血腦屏障發(fā)揮作用,而轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體OX-26是迄今被認(rèn)為最有前途的腦轉(zhuǎn)運(yùn)載體,它可攜帶NR1抗體通過血腦屏障,從而使得NR1抗體能夠在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用。因此,本研究旨在用噬菌體肽庫展示技術(shù)模擬小鼠NR1和TFR的抗原表位,構(gòu)建NR1-TfR融合蛋白真核表達(dá)載體,構(gòu)建單B細(xì)胞表位疫苗。
　　 方法:(1)利用噬菌體十二肽庫展示技術(shù)篩選小鼠NMD

3、AR1單克隆抗體MAB363的抗原表位篩選(本課題前期研究已完成),篩選小鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體OX-26的抗原表位優(yōu)勢克隆,(2)計(jì)算機(jī)模擬表位融合免疫原性蛋白的空間構(gòu)象,檢測其抗原性；(3)將MAB363和OX-26的抗原表位優(yōu)勢克隆通過linker串聯(lián)人工合成重組表位肽,進(jìn)行功能檢測；(4)將所得目的片段插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-NR1／TFR,利用電穿孔方法將其轉(zhuǎn)化入減毒傷寒沙門桿

4、菌制備重組表位疫苗；(5)通過western blot技術(shù)檢測質(zhì)粒在真核細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 結(jié)果:(1)通過噬菌體十二肽庫展示技術(shù)篩選出小鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體OX-26的抗原表位優(yōu)勢克隆氨基酸序列為GHIHSMRHHRPT。將人工合成的含目的氨基酸DDWVISTQSLKSGGGGSGGGGSGGGGSGHIHSMRHHRPT的多肽分別用MAB363和OX-26進(jìn)行western blot檢測,均能在2KD-8KD范圍內(nèi)產(chǎn)生

5、條帶,提示B細(xì)胞表位篩選正確,重組表位質(zhì)粒設(shè)計(jì)合理,所表達(dá)的蛋白能夠有效和相應(yīng)抗體特異性結(jié)合。(2)將MAB363和OX-26的抗原表位優(yōu)勢克隆通過linker串聯(lián)以保證兩者的獨(dú)立功能和空間構(gòu)象,命名為S。采用相關(guān)軟件預(yù)測重組表位蛋白Pro-S空間構(gòu)象:Pro-S蛋白質(zhì)序列在BLAST蛋白數(shù)據(jù)庫中未發(fā)現(xiàn)同源性較高(>30％)的蛋白質(zhì),其內(nèi)不含信號肽,屬非跨膜蛋白,且不含半胱氨酸而未形成二硫化合物影響蛋白折疊和功能發(fā)揮,不含α螺旋以保證結(jié)

6、構(gòu)的穩(wěn)定；NR1和TFR的抗原表位處于蛋白分子的表面,具有良好的抗原性、親水性,提示Pro-S抗原性較好,可能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)并產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。(3)成功構(gòu)建攜帶目的片段的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-NR1／TFR,命名為vec-s；并成功將其轉(zhuǎn)化至減毒沙門菌,制備濃度為1.6×109cfu／ml的減毒活疫苗。(4)將質(zhì)粒Vec-s轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞HEK293,48小時(shí)候后檢測vec-s的瞬時(shí)表達(dá),發(fā)現(xiàn)vec-s轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞總蛋白在