重組共表達(dá)載體psnav2.0hsv1tkireshil1ra的構(gòu)建及其在滑膜細(xì)胞中的表達(dá)

1、山東大學(xué)碩士學(xué)位論文重組共表達(dá)載體pSNAV2.0-HSV1-tk-IRES-hIL-1Ra的構(gòu)建及其在滑膜細(xì)胞中的表達(dá)姓名：劉青春申請學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：外科學(xué)（骨外）指導(dǎo)教師：張偉;李偉20090512山東大學(xué)碩士學(xué)位論文4 H S V I ．t k 和h I L - 1 R a 基因片段先后插入p M D ．I R E S 質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒p M D - H S V I ·t k —I R E S —h I L - I

2、 R a ，勛，zI 單酶切鑒定。5 I 芻p M D ．H S V l ．t k ．I R E S - h l L - 1 R a 質(zhì)粒酶切出H S V l ．t k ．I R E S - h I L - 1 R a 片段，克隆至A A V 載體質(zhì)粒p S N A V 2 ．O 上，構(gòu)建p S N A V 2 ．0 ．H S V I —t k - I R E S - h l L —I R a 質(zhì)粒，勛甩I 單酶切鑒定。6 取O A 患

3、者滑膜組織細(xì)胞，分離并傳代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況。7 借助L i p o f e e t a m i n e2 0 0 0 將p S N A V 2 ．0 ．H S V l ．t k ．I R E S ．h l L ．I R a 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至O A 滑膜細(xì)胞中。I 盯．P C R 檢測重組共表達(dá)質(zhì)粒p S N A V 2 ．0 ．H S V l ．t k ．I R E S ．h l L - 1 R a 在O A 滑膜細(xì)胞中的

4、表達(dá)。結(jié)果1 P C R 擴(kuò)增H S V I ．t k 、I R E S 、h I L - 1 R a 一= 段基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物分別為l1 5 3 b p 、6 2 2 b p 和5 4 6 b p 左右的D N A 條帶，與預(yù)期大小相符。2 對質(zhì)粒p M D - H S V l 一t k 、p M D - I R E S 和p M D —h I L - 1 R a J 掛行測序，結(jié)果與G e n B a n k中的序列進(jìn)行比對，所有

5、堿基序列完全正確。3 重組質(zhì)粒p M D —H S V I - t k - I R E S —h l L - 1 R a 的鑒定：重組質(zhì)粒經(jīng)K e n I 酶切得到3條分別為3 6 4 b p 、1 0 5 3 b p 和3 ．5 k b 左右的D N A 條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，證實(shí)重組質(zhì)粒p M D - H S V I - t k ．I R E S ．h l L - 1 R a 構(gòu)建成功。4 重組共表達(dá)質(zhì)粒p S N A V 2 ．0

6、 - H S V l 一t k - I R E S - h l L ．1 R a 的鑒定：重組質(zhì)粒．幺7 2 K p nI酶切，得到4 條分別) b 3 6 4 b p 、5 5 2 b p 、1 0 5 3 b p F ：l 】7 ．4 k b 左右的D N A 條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，證實(shí)重組共表達(dá)質(zhì)粒p S N A V 2 ．0 ．H S V l ．t k ．I R E S ．h l L - l R a 構(gòu)建成功。5 滑膜細(xì)胞原代培

7、養(yǎng)：滑膜細(xì)胞貼壁后，鏡下主要可見3 種類型的細(xì)胞，即樹突樣細(xì)胞( D C s ) 、巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞( M C s ) 和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞( F C s ) ，當(dāng)培養(yǎng)到第3 代時(shí)，F(xiàn) C s 占較大比例。6 H S V l ．t k 與h l I ．, - I R a 在O A 滑膜細(xì)胞中的表達(dá)：分別以轉(zhuǎn)染共表達(dá)質(zhì)粒組的反轉(zhuǎn)錄e D N A 、未轉(zhuǎn)染共表達(dá)質(zhì)粒組的反轉(zhuǎn)錄e D N A 及共表達(dá)質(zhì)粒為模板擴(kuò)增H S V I ．t k ．I