IL-3基因cDNA的克隆、測序及其在造血干細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、河北醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文IL3基因cDNA的克隆、測序及其在造血干細(xì)胞中的表達(dá)姓名：趙秀榮申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：病原生物學(xué)指導(dǎo)教師：王慶林徐大為20040301中文摘要保護(hù)堿基。(2)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離與培養(yǎng)：采集健康成人外周血，用Ficoll密度梯度法分離PBMC，在水平離心機(jī)，以2000r／m離心20min，離心后管內(nèi)液體分為三層，吸取白膜層即單個(gè)核細(xì)胞層，加入5倍體積的DMEM液洗滌細(xì)胞兩次，依次以2000r／m

2、離心10min，1500r／m離心10min后，加入含10％胎牛血清的DMEM液重懸細(xì)胞，按2106／ml培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶內(nèi)，其中含100U／ml青霉素，100u∥ml鏈霉素，10％胎牛血清，ConA為2011g／ml或PHA為50u∥ml，PMA10ng／ml的DMEM培養(yǎng)液中，于5％CO，37℃培養(yǎng)16小時(shí)。(3)用RTPCR(逆轉(zhuǎn)錄PCR)法合成I【。一3cDNA；收集上述細(xì)胞培養(yǎng)液，4℃以3009離心5min，棄上清，收集細(xì)胞，用冰

3、浴的PBS液洗一次，然后用RNA提取試劑盒提取總RNA，用1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完摯性：再以總RNA為模板，以primerl、primer2為上、下游引物，42℃1h后94℃2min使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，完成逆轉(zhuǎn)錄過程，即合成了IL一3cDNA的第一條鏈，在逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件是：94℃變性30s，50℃退火lmin，68℃延伸lmin，35個(gè)循環(huán)后，68℃再延伸7min。取擴(kuò)增產(chǎn)物5u1經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，如見

4、到預(yù)期大小的cDNA條帶，則表明IL一3RNA提取成功，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物完整，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。(4)將IL3cDNA克隆至pUCm—T，構(gòu)建pUCm一’F／IL一3cDNA，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(Ecoil)【)l15a(感受態(tài)大腸桿菌用氯化鈣法制各)，接種含預(yù)先川20J』1100mmol／LIPTG和100ul20mg／1Xgal涂布的氨芐青霉紊平板上，平板在37。C正向放置1h以吸收過多液體，然后37。CN置培養(yǎng)12—16h。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化