山羊Tet1基因克隆及其在胎盤的表達(dá)譜.pdf

1、生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)羔羊是養(yǎng)羊業(yè)中取得高經(jīng)濟(jì)效益的重要條件。山羊繁殖性能的充分發(fā)揮，不僅體現(xiàn)在產(chǎn)羔率高，還體現(xiàn)在羔羊品質(zhì)和成活率等性狀上。母羊的妊娠維持、胎兒的發(fā)育乃至出生后生長(zhǎng)情況都依賴于早期胎盤的正常發(fā)育。DNA甲基羥化酶TET1蛋白是Fe2+和2-氧化戊二酸依賴性型的雙加氧酶家族成員之一，參與調(diào)節(jié)DNA主動(dòng)、被動(dòng)去甲基化機(jī)制，將DNA5-甲基胞嘧啶（5mC）催化羥化為5-羥甲基胞嘧啶（5hmC），并可繼續(xù)將5hmC氧化為5-醛基胞嘧啶（5fC

2、）及5-羧基胞嘧啶（5caC），被TDG特異結(jié)合進(jìn)行堿基切除修復(fù)達(dá)到DNA主動(dòng)脫甲基化的目的，在維持胚胎干細(xì)胞的自我更新和多能性，保證干細(xì)胞分化成不同的組織器官有重要意義。但該分子調(diào)控妊娠期胎盤發(fā)育的分子機(jī)制研究尚屬空白，鑒于此，本研究首先克隆了山羊Tet1基因，然后探索了其在山羊胎盤不同發(fā)育階段的表達(dá)模式，對(duì)明確其調(diào)控山羊胎盤發(fā)育的機(jī)理，為山羊的分子育種及相關(guān)應(yīng)用基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　利用RT-PCR和RAC

3、E末端擴(kuò)增技術(shù)，首次克隆得到山羊Tet1基因cDNA，全長(zhǎng)序列7056 bp（GenBank：KU870424），開放閱讀框（ORF）長(zhǎng)6507 bp，除終止密碼子外翻譯2168個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)山羊TET1蛋白分子量為239677.2 Da，是一種親水性非分泌性、非膜結(jié)合的球狀蛋白。以DNA為模板擴(kuò)增得到山羊Tet1基因5’非翻譯區(qū)啟動(dòng)子序列856 bp，對(duì)其進(jìn)行CpG島預(yù)測(cè)顯示所擴(kuò)增的該序列無明顯的CpG島，預(yù)測(cè)得到兩個(gè)核心啟動(dòng)子區(qū)序列

4、分別是GATCAGACCTG TGTCCCCTGCACTGGCAGCCAGATTCTTATCTACTGTAC和TTCTTGAAGTGC ACAGGCTTCTCATTGTGGTGGCTTCTTTTATTTTGGAT。山羊TET1蛋白與TET家族其它成員間的同源性不高，與TET2為24.9％，與TET3的同源性為23.9%，與牛、馬、人、猴、小鼠、猩猩、大鼠和豬的同源性分別是95.4%、86.1%、78.3%、78.3%、56.7%、76.

5、5%、57.9%和87.3%，與牛的同源性最高，與小鼠的同源性最低。山羊Tet1組織表達(dá)譜分析結(jié)果表明，Tet1基因在肌肉中表達(dá)最高，在睪丸、子葉、卵巢等與繁殖相關(guān)的組織中也有較高的表達(dá)，在肝和腎中表達(dá)最低，這一結(jié)果說明Tet1基因可能參與調(diào)控了山羊相關(guān)的繁殖生理過程。
　　通過實(shí)時(shí)熒光定量對(duì)Tet1基因在山羊胎盤不同發(fā)育階段中的表達(dá)模式分析表明，Tet1在妊娠25 d山羊胎兒胎盤中的相對(duì)表達(dá)水平極顯著高于60 d、90~120

6、d和150 d的表達(dá)（P<0.01），顯著高于妊娠20 d和30 d的表達(dá)水平（P<0.05），Tet1基因表達(dá)量在妊娠25 d、30 d、60 d、90~120 d和150 d期間呈下降趨勢(shì)。這一結(jié)果初步表明 Tet1基因在妊娠早期（胚胎植入和胎兒形成）中可能發(fā)揮了重要作用。另對(duì)Dnmts的定量PCR結(jié)果表明，在妊娠早期20、25和30 d山羊胎盤中，甲基化標(biāo)記物Dnmt3a的相對(duì)表達(dá)量呈增加趨勢(shì)，在妊娠30 d的胎盤中Dnmt1的表