鯉Romo1基因的克隆、鑒定及其表達研究.pdf

1、活性氧調節(jié)基因Romo1是細胞內一類重要的供氧因子，它位于線粒體上并通過線粒體電子傳遞鏈復合物Ⅲ誘導線粒體ROS的產(chǎn)生。在生理條件下，Romo1維持細胞內ROS的穩(wěn)態(tài)水平來保持機體內氧化還原平衡，同時促進老化細胞和癌細胞的凋亡，并且通過調節(jié)P27基因的表達，在細胞增殖中起重要的作用，此外該基因是細胞周期從G1期到S期所必須的。因此，Romo1對細胞的生長和生存起重要的作用。在外源性刺激下，如無血清狀態(tài)和抗癌藥物的刺激時，Romo1基因的

2、表達量增加，進而增加細胞內ROS的水平以應對外源性刺激反應。
　　活性氧基團(Reactive oxygen species，ROS）是一類具有活性的含氧化合物，它主要是有機體在有氧代謝中通過線粒體電子傳遞鏈復合物Ⅰ和Ⅲ產(chǎn)生的。細胞內正常 ROS水平是在0.001μΜ和～0.7μΜ之間，過量的ROS通過抗氧化系統(tǒng)被除去進而來維持氧化還原體內平衡。ROS產(chǎn)量的失衡狀態(tài)會改變細胞內氧化還原平衡狀態(tài)，會對細胞和基因結構造成損壞，引起DN

3、A破壞，促進癌癥的發(fā)生。盡管ROS存在許多負面效應，但是適當?shù)腞OS的水平在細胞生長和生存中有重要作用，并且在參與固有免疫應答和適應性免疫應答的抗菌、消炎中具有重要意義。
　　近年來，國內外對于人類Romo1基因及其編碼蛋白的研究取得了初步成果，但是在硬骨魚中只在斑馬魚中有報道，在鯉魚中關于Romo1基因的研究至今沒有報道，并且雖然Romo1有多種功能，但是對于Romo1的免疫功能研究甚少，目前為止僅在七鰓鰻中研究過該基因的免疫功

4、能，在鯉魚中還未曾研究。
　　本研究首先對已報道的多個物種的Romo1基因cDNA序列進行比對，根據(jù)保守區(qū)設計引物利用反轉錄PCR和RACE方法，首次克隆得到鯉魚（Cyprinus carpio.L）Romo1 cDNA全長序列。鯉魚Romo1基因cDNA序列全長為480bp,包含112bp的5，-非編碼區(qū)（5，-UTR），240bp的開放閱讀框（ORF）及128bp的3，-非編碼區(qū)（3，-URT）。其中鯉魚Romo1 mRNA的

5、ORF區(qū)編碼79個氨基酸。運用Expasy的在線軟件Protparam分析蛋白質的理化性質，結果顯示Romo1蛋白質的理論分子量為8.3198KDa；理論等電點為9.89；SMART預測蛋白結構顯示在氨基酸序列的第23-45位具有一個跨膜結構域，在21-40位氨基酸處具有overlop環(huán)狀結構；其次用BioEdit7.0軟件，將鯉魚Romo1氨基酸序列與多個物種的Romo1氨基酸序列進行比對，比對結果顯示鯉魚Romo1氨基酸序列與其他物

6、種的Romo1氨基酸序列同源性很高，在進化上高度保守。運用MEGA5.2軟件構建各個物種Romo1蛋白系統(tǒng)進化樹。如圖9所示，鯉魚Romo1與青鱂Romo1相似度最高，親緣關系最近。通過進一步的氨基酸序列一致性比較，進一步驗證了克隆到的鯉魚活性氧調節(jié)基因 Romo1的進化地位。
　　利用Real-time PCR方法分析了Romo1 mRNA在正常鯉魚肝、脾、鰓、頭腎、前腸、后腸、皮膚、肌肉、腦、性腺、口腔上皮11種組織中的表達差

7、異，結果分析得Romo1在鯉魚的體內表達廣泛。
　　本研究利用魚類常見的致病菌嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）注射刺激鯉魚后，用實時熒光定量PCR分析注射刺激后不同的鯉魚免疫相關組織中的Romo1 mRNA在不同時間段的表達量變化狀況，初步研究鯉魚Romo1的免疫功能。結果顯示，Romo1 mRNA水平在鯉魚頭腎、肝臟、前腸、后腸、鰓中顯著上調。其中，免疫刺激后鯉魚 Romo1的表達量在前腸中升高最明顯，鰓