豬瘟病毒E2基因的克隆及其在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、該文利用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和套式PCR(nPCR)技術(shù),對(duì)流行于國(guó)內(nèi)部分地區(qū)的9株豬瘟病毒(CSFV)E2基因進(jìn)行克隆,并對(duì)其核苷酸及氨基酸序列的同源性進(jìn)行比較及分析,繪制了系統(tǒng)關(guān)系發(fā)生樹(shù),以期了解近期豬瘟流行野毒主要保護(hù)性抗原E2基因的變異情況,為豬瘟的防制提供分子流行病學(xué)方面的資料.同時(shí)以1株(陜西周至株)為材料,在昆蟲(chóng)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),為新型豬瘟基因工程亞單位疫苗的研制奠定了基礎(chǔ).(1)采用RT-PCR和nPCR擴(kuò)增出9株

2、國(guó)內(nèi)近期豬瘟流行野毒株的E2基因,將其分別克隆于pMD18-T載體并進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定,根據(jù)C-株,Brescia株,Alfort株及Shime株確定起始氨基酸三聯(lián)體的正確位置后進(jìn)行氨基酸序列推導(dǎo),并進(jìn)行了同源性比較,繪制了系統(tǒng)關(guān)系發(fā)生樹(shù).結(jié)果表明,所測(cè)9株CSFV E2基因的長(zhǎng)度均為1324 bp,編碼的氨基酸序列均包括完整信號(hào)肽序列和跨膜序列,共由442個(gè)氨基酸殘基組成.可將13株(包括4株參考毒株)CSFV分為兩個(gè)組群,GXGL,

3、GXNN,LNAS,SDJN 4株毒株與C株,Shimen株,Alfort株和Brescia株同為一個(gè)群組,其E2基因間的核苷酸序列同源性為94.0%~99.4%,所推導(dǎo)氨基酸序列同源性為93.7%~99.5%.HNLS,SXZZ,HNCA,HNXY和HNDX 5株同為另一群組,之間核苷酸序列同源性為81.9%~99.7%,所推導(dǎo)氨基酸序列同源性為88.2%~99.1%.13株E2基因間的核苷酸序列同源性為81.9%~99.7%,所推導(dǎo)

4、氨基酸序列同源性為88.2%~99.5%,其中9株流行野毒與4株參考毒株之間核苷酸序列同源性為81.9%~98.9%,所推導(dǎo)氨基酸序列同源性為88.2%~99.5%.說(shuō)明近期流行毒株的變異呈現(xiàn)一定的多樣性.通過(guò)對(duì)主要抗原區(qū)域氨基酸位點(diǎn)變異進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)各毒株間抗原決定簇未發(fā)生明顯的變異.(2)對(duì)已知的E2基因進(jìn)行分析后,用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)從陜西周至株克隆化E2全基因中擴(kuò)增出除去3′端跨膜區(qū)的特異性片段(1 033 bp),并在其

5、兩端引入BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn),將其亞克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTb,獲得重組質(zhì)粒pFBHT-E2,轉(zhuǎn)化進(jìn)含穿梭載體Bacmid的感受態(tài)細(xì)胞DH10Bac,得到含E2基因的重組載體質(zhì)粒rBacmid-E2,以脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將此重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞,經(jīng)SDS-PAGE和Western-blotting及ELASA等方法檢測(cè),結(jié)果表明,此E2基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞中正確表達(dá),表達(dá)的蛋白能與豬瘟陽(yáng)性血清發(fā)生特異性