猿猴空泡病毒40（SV40）T基因的克隆與表達(dá)及其多抗在轉(zhuǎn)基因小鼠中的應(yīng)用.pdf

1、猿猴空泡病毒40(SV40)是60年代初發(fā)現(xiàn)分離的猴腎細(xì)胞病毒,它是一種DNA病毒,其在體外可使人及動(dòng)物多種組織類型正常細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化,在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)可誘發(fā)多種腫瘤形成,并且人類許多腫瘤的發(fā)生也與之有關(guān).近年來(lái),人們對(duì)SV40與人類腫瘤的關(guān)系進(jìn)行了大量的研究.該實(shí)驗(yàn)室建立的SV40轉(zhuǎn)基因小鼠腫瘤模型多發(fā)胰腺癌,為進(jìn)一步研究SV40與腫瘤發(fā)生的關(guān)系,為人們研究癌癥的病因、發(fā)病機(jī)理以及治療提供有力的工具打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ).該文通過(guò)抽提COS

2、-1細(xì)胞總RNA作為模板,根據(jù)GenBank中SV40 T基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物,用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出921bp的SV40 T基因片段,克隆到pGEM-T easy載體中,經(jīng)測(cè)序后,再亞克隆到pGEX-6p-1谷光甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因的下游,獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,用IPTG誘導(dǎo)SV40 T基因片段的表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE電泳及western-blotting分析,GST-S融合蛋白的分子質(zhì)量為53kDa.用該

3、表達(dá)產(chǎn)物免疫新西蘭大白兔,所制備的抗血清經(jīng)間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(IFA)顯示可與COS-1細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng),表明采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)的融合蛋白具有SV40 T抗原的免疫原性.用所制備的兔多抗血清(多克隆抗體IgG)為一抗,對(duì)該實(shí)驗(yàn)室的不同發(fā)育時(shí)期的SV40轉(zhuǎn)基因小鼠的各重要器官和腫瘤組織進(jìn)行SABC法免疫組織化學(xué)檢測(cè),發(fā)現(xiàn)只有發(fā)瘤小鼠的腫瘤組織細(xì)胞有特異性的棕黃色顆粒,呈陽(yáng)性反應(yīng),表明由于SV40T抗原的表達(dá)使得正常的胰腺細(xì)胞發(fā)