SV40T轉(zhuǎn)基因小鼠純合子品系的建立及其發(fā)病機(jī)制的研究.pdf

1、猴空泡病毒40(SV40),是一種DNA病毒,SV40T是SV40中調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的重要蛋白,其在體外可使人及動(dòng)物的多種組織類型正常細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化,常用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制作,在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)可誘發(fā)多種腫瘤形成。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)SV40工具有與抑癌蛋白P53,PRb等形成特異性復(fù)合物的能力,使它們的抑癌活性喪失,從而促使細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。
　　 在本課題的前期研究中,利用顯微注射法制備了胃壁細(xì)胞特異性表達(dá)SV40T抗原的轉(zhuǎn)基因小鼠。通過近

2、兩年的傳代,SV40T基因已經(jīng)在小鼠體內(nèi)穩(wěn)定遺傳和表達(dá),并已致成了小鼠胃粘膜的增生和癌變。本研究通過熒光定量PCR篩選,測(cè)交驗(yàn)證和全同胞交配,建立了胃壁細(xì)胞特異性表達(dá)SV40T抗原的純合子轉(zhuǎn)基因小鼠品系,并鑒定了8個(gè)品系的外源基因拷貝數(shù)；通過免疫共沉淀和Westernblot驗(yàn)證了SV40T在小鼠體內(nèi)與抑癌蛋白P53形成了復(fù)合物,致成P53蛋白的部分失活,可使P53對(duì)其下游基因bcl-2失去抑制,bcl-2基因在轉(zhuǎn)基因小鼠的胃粘膜中過量

3、表達(dá),這可能是轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生胃部病變的因?yàn)橹弧?br>　　 方法：
　　 一.純合子轉(zhuǎn)基因小鼠品系的建立
　　 1.小鼠的傳代:將F0、F1代中的陽性轉(zhuǎn)基因小鼠分別與野生型B6鼠進(jìn)行交配,獲得F1、F2代鼠。F2代陽性鼠間進(jìn)行全同胞兄妹交配,獲得F3代轉(zhuǎn)基因小鼠,根據(jù)孟德爾定律F3代中應(yīng)該至少有25％的純合子。通過熒光定量PCR的2-ΔΔCt法篩選純合子小鼠。
　　 2.純合子小鼠的驗(yàn)證與品系的建立:將用熒光

4、定量PCR篩選出的純合子小鼠與B6鼠進(jìn)行測(cè)交,檢測(cè)后代鼠來驗(yàn)證熒光定量PCR的結(jié)果。最后將純合子小鼠按全同胞交配方式建立純合子SV40T轉(zhuǎn)基因小鼠品系。
　　 3.外源基因拷貝數(shù)的鑒定:采用相對(duì)定量的2-ΔΔCt法,用單拷貝基因β2m(β2微球蛋白)作為內(nèi)參照。用已知的雜合子小鼠作為模板,以2-ΔΔCt計(jì)算出的結(jié)果要乘以2才是基因組中外源基因的拷貝數(shù)。
　　 二.轉(zhuǎn)基因小鼠胃部病變因?yàn)榈难芯?br>　　 1.轉(zhuǎn)基因小鼠

5、胃酸分泌情況的檢測(cè)。取野生型B6鼠和各品系轉(zhuǎn)基因鼠若干只,禁食一天后吸取胃液檢測(cè)pH值。
　　 2.通過石蠟切片和HE染色來觀察轉(zhuǎn)基因小鼠胃部的病變情況。取野生型B6鼠和胃部病變嚴(yán)重和不嚴(yán)重的轉(zhuǎn)基因鼠若干只,取胃組織進(jìn)行常規(guī)切片、HE染色后觀察轉(zhuǎn)基因鼠胃粘膜的形態(tài)變化。
　　 3.通過免疫共沉淀和Western blot技術(shù)驗(yàn)證外源的SV40T蛋白能在小鼠體內(nèi)與內(nèi)源的P53蛋白結(jié)合。
　　 4.通過RT-PCR來

6、檢測(cè)P53蛋白下游的3個(gè)主要基因bax、p21、bcl-2和兩個(gè)胃壁細(xì)胞特異性基因H+/K+ATPase、內(nèi)因子的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 一.純合子小鼠品系的建立
　　 1.小鼠的傳代與純合子的篩選:用定量PCR法在6個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠品系中選育出17只純合子小鼠。
　　 2.純合子轉(zhuǎn)基因小鼠的驗(yàn)證與品系的建立:經(jīng)過測(cè)交驗(yàn)證它們與野生型小鼠所生的后代都為陽性,證明了熒光定量PCR的結(jié)果是正確的,通過純合

7、子之間的全同胞交配建立了6個(gè)獨(dú)立的純合子品系。
　　 3.得到了8個(gè)品系的轉(zhuǎn)基因小鼠中外源基因的拷貝數(shù),其中16＃、57＃、61＃品系中SV40T基因的拷貝數(shù)為1；4＃、24＃、51＃品系中SV40T基因的拷貝數(shù)為2；73＃品系中SV40T基因的拷貝數(shù)為3；2＃品系中SV40T基因的拷貝數(shù)為5。
　　 二.轉(zhuǎn)基因小鼠胃部病變因?yàn)榈某跆?br>　　 1.轉(zhuǎn)基因小鼠胃酸值的測(cè)定。發(fā)現(xiàn)并不是所有的轉(zhuǎn)基因小鼠的胃酸值都不正常,

8、而是在不同的品系有不同的比例。其中2＃和73＃轉(zhuǎn)基因小鼠品系中胃酸值不正常的小鼠比例最高。
　　 2.通過石蠟切片和HE染色來觀察轉(zhuǎn)基因小鼠胃部的病變情況。在病理切片中可以看到轉(zhuǎn)基因小鼠的胃粘膜發(fā)生了明顯的增生,成熟壁細(xì)胞的數(shù)量減少或消失,一些病情較嚴(yán)重的小鼠胃粘膜出現(xiàn)了早期癌變的癥狀。
　　 3.通過免疫共沉淀和Western bolt技術(shù)證明了外源蛋白SV40T在小鼠體內(nèi)與內(nèi)源蛋白P53形成了復(fù)合物。
　　

9、4.通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因小鼠中本應(yīng)該由P53蛋白所抑制表達(dá)的bcl-2基因的表達(dá)量反而比未轉(zhuǎn)基因小鼠有了明顯的增高,而bax和p21基因的表達(dá)量也出現(xiàn)了增高。在胃部病變較嚴(yán)重的小鼠中由于胃壁細(xì)胞的大量凋亡,使兩個(gè)胃壁細(xì)胞特異性基因H+/K+ATPase、內(nèi)因子的表達(dá)都出現(xiàn)了明顯的降低。
　　 結(jié)論：
　　 1.建立了6個(gè)SV40T轉(zhuǎn)基因小鼠的純合子品系,并得到了8個(gè)品系的轉(zhuǎn)基因小鼠中外源基因SV40T的拷貝數(shù)。<