永生化基因SV40T對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響.pdf

1、國(guó)內(nèi)外研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）具有極強(qiáng)的多向分化潛能，來(lái)源廣泛，且BMSCs具有低免疫原性，應(yīng)用方便。有研究表明BMSCs暴露于受損的肝臟組織中時(shí)可迅速轉(zhuǎn)換成健康的肝臟細(xì)胞，幫助修復(fù)受損的肝臟；BMSCs的移植可以在體內(nèi)修復(fù)受損的肝臟，而對(duì)非受損肝臟無(wú)明顯影響。有研究人員將人BMSCs導(dǎo)入到神經(jīng)系統(tǒng)受損失的大鼠中后，發(fā)現(xiàn)移植的BMSCs優(yōu)先定居于受損的

2、神經(jīng)系統(tǒng)中，分化為少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，使神經(jīng)系統(tǒng)恢復(fù)較好。人BMSCs還可通過(guò)Ⅰ型膠原等建立三維的軟骨組織，從而為軟骨損失患者的治療帶來(lái)新的希望。因此，BMSCs誘導(dǎo)分化和移植是目前研究的熱點(diǎn)之一。 但BMSCs移植尚存在細(xì)胞數(shù)量不足，需要體外擴(kuò)增，但該細(xì)胞存在體外傳代、凍存及復(fù)蘇后增殖及分化能力下降等問(wèn)題，研究表明：當(dāng)細(xì)胞傳至6-7代后，細(xì)胞出現(xiàn)明顯衰老現(xiàn)象，其活性及分化能力等明顯下降，這嚴(yán)重影響其進(jìn)一步應(yīng)用。 目前國(guó)內(nèi)

3、外尚無(wú)通過(guò)pCMVSV40T/PUR質(zhì)粒將永生化基因SV40T導(dǎo)入BMSCs的相關(guān)報(bào)道，本研究擬通過(guò)將pCMVSV40T/PUR質(zhì)粒將永生化基因SV40T導(dǎo)入BMSCs（簡(jiǎn)稱SBMSCs）中，并通過(guò)與未處理的BMSCs（簡(jiǎn)稱NBMSCs）分別從形態(tài)、生長(zhǎng)曲線等比較，分析基因?qū)牒髮?duì)該細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的影響，并通過(guò)不同濃度的血清對(duì)其培養(yǎng)及凍存，研究該細(xì)胞部分生物學(xué)特性，本實(shí)驗(yàn)還采用2種不同的方法提取BMSCs，并對(duì)它們進(jìn)行比較，找到2者的優(yōu)缺

4、點(diǎn)。 目的： 1．采用改良后的貼壁法及percoll梯度離心分離法提取BMSCs，并從形態(tài)、生長(zhǎng)速度等方面比較兩者的區(qū)別。 2．通過(guò)不同濃度的嘌呤霉素對(duì)BMSCs進(jìn)行篩選，找到最佳篩選濃度； 3．通過(guò)pCMVSV40T/PUR質(zhì)粒將永生化基因SV40T導(dǎo)入BMSCs，并從形態(tài)、生長(zhǎng)曲線等方面，比較SBMSCs與未處理BMSCs之間的差異性。 材料和方法: 1．采用改良后的貼壁法及perco

5、ll梯度離心法提取BMSCs： 改良貼壁法：用咬骨鉗咬斷股、腓及脛骨，再用注射器吹吸骨髓腔，使骨髓混于裝有含10%-15%胎牛血清、100IU/ml雙抗及0．1%hepes液的DMEM培養(yǎng)基中；用注射器進(jìn)行吹打，使骨髓與培養(yǎng)基充分混勻；吸取混合液，通過(guò)200目的篩網(wǎng)濾過(guò)后將其置于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)；3天后換液，第一次換液時(shí)用滴管對(duì)細(xì)胞面進(jìn)行輕度沖洗，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到80%匯合（7天左右）時(shí)1：2傳代。 percoll梯度離心法：用咬

6、骨鉗咬斷股、腓及脛骨，用注射器吹打骨髓腔，使骨髓混于裝有含2%胎牛血清、40單位的肝素的DMEM培養(yǎng)基；用吸管吹打，使骨髓與培養(yǎng)基混勻；吸取混合液，入15ml離心管，900g/min離心10min；吸去離心管上層脂肪，吸管吹打混勻細(xì)胞；取離心管，加入2．5ml比重1．073g/ml的percoll分離液，取上述BMSCs混合液，沿著離心管壁加入后，繼續(xù)900g/min離心30min；吸取細(xì)胞層及少許上層培養(yǎng)液入另一離心管，800g/mi

7、n離心10min；快速倒出上層液體，含2%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基洗滌3次，800g/min離心10min；快速倒出上層液體，加含10%-15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基2ml，移入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)到80%匯合（10天左右天）時(shí)1：2傳代。 2．取第3代對(duì)數(shù)期BMSCs，將其置于含10%-15%胎牛血清、0．1%hepes液的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于24孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞達(dá)60%～70%匯合時(shí)，換液，每孔加0．25ml上述培養(yǎng)

8、基，再加入嘌呤霉素，使其濃度分別為0．5ug/ml、0．8ug/ml、1．0ug/ml和2．0ug/ml。 3．取第3代對(duì)數(shù)期BMSCs，將其置于含10%-15%胎牛血清及0．1%hepes液的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。置于24孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞達(dá)60%～70%匯合時(shí)，移除上方原培養(yǎng)液，在每孔里加入500ul Opti-MEM。制備A、B液：取0．8ugpCMVSV40T/PUR質(zhì)粒，將其加入到50ul Opti-MEM中混合后制備

9、A液；2．5ulLipofectamineTM 2000加入到50ul Opti-MEM中，充分混合后，在室溫下（20℃-25℃）培養(yǎng)5分鐘，制備為B液；A、B液混合后，在室溫下培養(yǎng)20分鐘后，取該混合液加入到上述培養(yǎng)板中，每孔100ul。充分混合后，在37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5小時(shí)后，將該培養(yǎng)基換為DMEM完全培養(yǎng)基。將上述BMSCs在室溫下培養(yǎng)12小時(shí)后，加入嘌呤霉素篩選濃度，5天后，進(jìn)行分離及擴(kuò)增。 4. RT-PCR擴(kuò)

10、增cDNA序列引物設(shè)計(jì): 上游引物：5'-TATGTTTCAGGTTCAGGG-3'，下游引物：5'-TGGAATAGTCACCATGAATG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為558 bp。 5. 細(xì)胞計(jì)數(shù)并描繪其生長(zhǎng)曲線： NBMSCs傳代至15代后其很難繼續(xù)傳代，故選取第15代BMSCs為研究對(duì)象，以1．2×104/c㎡密度接種于12個(gè)6孔培養(yǎng)板內(nèi)，SBMSCs為6個(gè)6孔培養(yǎng)板，NBMSCs為6個(gè)6孔培養(yǎng)板，每孔加2ml

11、，培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)1-6天后，每天消化SBMSCs及NBMSCs各1個(gè)培養(yǎng)板，計(jì)數(shù)，取平均數(shù)，記錄結(jié)果，描繪其生長(zhǎng)曲線。 6．細(xì)胞細(xì)胞存活率： 當(dāng)細(xì)胞傳代至15代時(shí)，培養(yǎng)3天后消化，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)拒染率計(jì)算SBMSCs及NBMSCs的細(xì)胞存活率。 7．最佳血清培養(yǎng)濃度： 通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)下列各組細(xì)胞傳代時(shí)間較短，細(xì)胞活性較好：（1）5%胎牛血清+95%DMEM培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱5%血清培養(yǎng)組）；（2）10%胎牛血清+

12、90%DMEM培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱10%血清培養(yǎng)組）；（3）20%胎牛血清+80%DMEM培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱20%血清培養(yǎng)組）；（4）30%胎牛血清+70%DMEM培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱30%血清培養(yǎng)組）。本實(shí)驗(yàn)采用上述幾組血清濃度進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，每組6個(gè)單位，找到最佳的血清培養(yǎng)濃度。 8．最佳血清凍存濃度： SBMSCs采用以下不同的血清濃度組進(jìn)行細(xì)胞凍存：①10%DMSO+20%胎牛血清+70%DMEM培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱20%血清組）；②10%DM

13、SO+50%胎牛血清+40%DMEM培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱50%血清組）；③10%DMS0+90%胎牛血清（簡(jiǎn)稱90%血清組），每組5個(gè)單位。復(fù)蘇后采用胎盤藍(lán)染色進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)。 結(jié)果： 1、試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)改良貼壁法及percoll梯度離心法提取BMSCs從形態(tài)及生長(zhǎng)速度上看兩者無(wú)顯著性差異，且發(fā)現(xiàn)貼壁法第一次換液時(shí)稍用滴管對(duì)細(xì)胞面進(jìn)行輕度沖洗，可使BMSCs純度更高、活性更好，改良貼壁法提取的細(xì)胞傳代至3代后，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定分析為

14、CD29+/CD44+/CD45-，證明其為BMSCs。 2、試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)嘌呤霉素濃度為1．0ug/ml、2．0ug/ml時(shí)，5天后，細(xì)胞全死亡，而濃度為0．8ug/ml、0．5ug/ml細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞部分死亡。 3．SBMSCs傳代至15代后，RT-PCR后，進(jìn)行電泳分析發(fā)現(xiàn)顯示擴(kuò)增出的條帶約在560bp，說(shuō)明SV40T基因已成功轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中。 4．傳代至15代后，繼續(xù)培養(yǎng)3天后發(fā)現(xiàn)SBMSCs細(xì)胞形態(tài)較好，而NB

15、MSCs在第7代時(shí)細(xì)胞增長(zhǎng)速度減慢，約10天左右傳一代，且細(xì)胞形態(tài)有所改變，當(dāng)傳至15代時(shí)，細(xì)胞表現(xiàn)出皺縮，體積增大，胞體變平，很難繼續(xù)傳代。 5．兩組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線：以時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)目為縱坐標(biāo)繪制2組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，SBMSCs的生長(zhǎng)曲線呈“S”形，而NBMSC“S”形曲線較平坦，證明SBMSCs細(xì)胞的增長(zhǎng)速度明顯快于NBMSCs。 6．細(xì)胞存活率：當(dāng)細(xì)胞傳代至15代時(shí)，培養(yǎng)3天后消化，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)拒染率計(jì)算細(xì)胞存

16、活率，SBMSCs細(xì)胞存活率為（78．60±3．66）%，NBMSCs細(xì)胞存活率為（50．9±3．78）%（P<0．01）。 7．血清培養(yǎng)濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)速度的影響各血清培養(yǎng)組均呈“S”形（圖3），其中以20%血清組生長(zhǎng)速度最快。 8．血清濃度對(duì)細(xì)胞復(fù)蘇后活性的影響各組細(xì)胞凍存1周后進(jìn)行復(fù)蘇，通過(guò)胎盤藍(lán)拒染率計(jì)算細(xì)胞存活率。通過(guò)方差齊性分析發(fā)現(xiàn)各組間方差齊（P>0．05）。采用方差及SNK-q分析：不同濃度組之間SBMSC

17、s復(fù)蘇后的存活率進(jìn)行方差分析示差異有顯著性意義（P<0．01）。進(jìn)一步SNK-q兩兩比較顯示：90%血清組、50%血清組細(xì)胞存活率顯著性高于20%血清組（P<0．01）；50%血清組與90%血清組存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05）。 結(jié)論： 1．改良貼壁法提取的BMSCs從形態(tài)及細(xì)胞數(shù)量上與percoll梯度離心法提取的BMSCs無(wú)顯著性差異，且具有方便、不易污染及較經(jīng)濟(jì)的獲取BMSCs等優(yōu)點(diǎn)。 2．嘌呤霉素