SV40T抗原基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901的生物學(xué)效應(yīng).pdf

1、猴病毒40(Simian virus40,SV40)是一種DNA腫瘤病毒,在體外可以轉(zhuǎn)化細(xì)胞并誘發(fā)動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生腫瘤,在人類多種腫瘤中已檢測(cè)到SV40基因的存在和表達(dá)。SV40與人類腫瘤關(guān)系密切,它的致瘤性和轉(zhuǎn)化細(xì)胞能力主要與其編碼的早期蛋白T抗原(T antigen,Tag)有關(guān)。SV40Tag能夠和抑癌蛋白p53和Rb等結(jié)合并使之失活,導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)失控和惡性增殖,被認(rèn)為是SV40Tag致瘤發(fā)生的重要機(jī)制。SV40Tag可以整合入細(xì)胞基

2、因組中破壞其結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性,反式激活細(xì)胞基因的表達(dá)并啟動(dòng)宿主DNA的復(fù)制轉(zhuǎn)錄等。SV40Tag對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化起決定性作用,與細(xì)胞增殖及腫瘤發(fā)生密切相關(guān),它可以誘發(fā)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生多種類型腫瘤,被廣泛用于腫瘤發(fā)生機(jī)制的研究。
　　利用SV40Tag基因與組織表達(dá)特異性的啟動(dòng)子相結(jié)合,已經(jīng)成功制備多種轉(zhuǎn)基因小鼠腫瘤模型。H+/K+ATPase基因在胃壁細(xì)胞中特異性表達(dá),利用胃壁細(xì)胞特異性H+/K+ATPaseβ亞基啟動(dòng)子建立SV40Tag基因

3、轉(zhuǎn)基因小鼠胃癌模型,可用于胃癌發(fā)病機(jī)制的研究,同時(shí)為胃癌的預(yù)防和治療提供有力的工具。
　　在以往研究的基礎(chǔ)上,本實(shí)驗(yàn)將H+/K+ATPaseβ亞基啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)SV40Tag基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)/HKSV轉(zhuǎn)染入SGC7901、EC9706和KB細(xì)胞中,通過G418篩選和擴(kuò)大培養(yǎng),獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。應(yīng)用PCR、RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法檢測(cè)SV40Tag基因在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的整合與表達(dá)情況,并且觀察S

4、V40Tag基因的表達(dá)對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901生物學(xué)特性的影響,探討SV40Tag的作用機(jī)制及SV40Tag基因表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,為進(jìn)一步轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的構(gòu)建奠定理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　材料與方法:
　　1.質(zhì)粒的擴(kuò)增、提取和酶切鑒定提取質(zhì)粒pcDNA3.1(-)、pcDNA3.1(-)/HKSV與pcDNA3.1(-)/SV,利用限制性內(nèi)切酶酶切鑒定質(zhì)粒,將質(zhì)粒用BamHⅠ酶切,瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
　　2.

5、細(xì)胞轉(zhuǎn)染利用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000,將含有SV40Tag基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)/SV和pcDNA3.1(-)/HKSV轉(zhuǎn)染入SGC7901、EC9706和KB細(xì)胞中,用G418進(jìn)行篩選,將獲得的陽性細(xì)胞克隆擴(kuò)大培養(yǎng),得到體外穩(wěn)定傳代的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。
　　3.檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中SV40Tag基因的表達(dá)SV40Tag基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后,從DNA、RNA和蛋白質(zhì)三個(gè)水平上檢測(cè)SV40Tag基因的整合和表

6、達(dá)。提取轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因組DNA,利用Tag基因特異性引物PCR擴(kuò)增檢測(cè)SV40Tag基因的表達(dá);提取細(xì)胞總RNA,RT-PCR檢測(cè)SV40Tag基因mRNA的表達(dá);免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中SV40Tag的表達(dá)。
　　4.檢測(cè)轉(zhuǎn)染SV40Tag基因的SGC7901細(xì)胞生物學(xué)特性變化MTT法檢測(cè)SV40Tag基因轉(zhuǎn)染前后SGC7901細(xì)胞增殖能力變化;應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期分析。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

7、SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行組間差異比較,以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　結(jié)果:
　　1.質(zhì)粒的酶切鑒定pcDNA3.1(-)/HKSV用BamHⅠ單酶切電泳,可見到約2.7kb與6.4kb兩條DNA條帶;pcDNA3.1(-)/SV用BamHⅠ單酶切電泳,可見到約2.7kb與5.4kb兩條DNA條帶;pcDNA3.1(-)用BamHⅠ單酶切電泳,僅見到

8、一條5.4kb的DNA條帶,與預(yù)期結(jié)果相符,可用于下一步的實(shí)驗(yàn)。
　　2.PCR各組細(xì)胞均可擴(kuò)增出443bp的內(nèi)參照GAPDH條帶,pcDNA3.1(-)/HKSV與pcDNA3.1(-)/SV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SGC7901、EC9706和KB細(xì)胞均可擴(kuò)增出618bp的SV40Tag基因特異性條帶,未轉(zhuǎn)染細(xì)胞與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞均無此條帶出現(xiàn)。
　　3.RT-PCR各組細(xì)胞均擴(kuò)增出443bp的內(nèi)參照GAPDH條帶,pcDNA3.1(-

9、)/HKSV與pcDNA3.1(-)/SV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SGC7901、EC9706和KB細(xì)胞均擴(kuò)增出272bp的SV40Tag基因特異性條帶,未轉(zhuǎn)染細(xì)胞與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測(cè)不到此條帶。
　　4.免疫細(xì)胞化學(xué)染色pcDNA3.1(-)/HKSV與pcDNA3.1(-)/SV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SGC7901、EC9706和KB細(xì)胞中均檢測(cè)到SV40Tag的陽性表達(dá),未轉(zhuǎn)染細(xì)胞與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞無SV40Tag的表達(dá)。
　　5.MTT結(jié)果pc

10、DNA3.1(-)/HKSV和pcDNA3.1(-)/SV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SGC7901細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖速度比未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞明顯加快,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　6.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果pcDNA3.1(-)/HKSV與pcDNA3.1(-)/SV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SGC7901細(xì)胞中G1期細(xì)胞比例減少及PI指數(shù)增加,與未轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞和空質(zhì)粒p