重組人cTnI優(yōu)化表達(dá)和純化工藝建立及其抗體制備.pdf

1、人心肌肌鈣蛋白I（human cardiac troponin I，cTnI）是檢測(cè)心肌損傷的重要標(biāo)志物，目前臨床使用的檢測(cè)cTnI的試劑盒，由于抗體針對(duì)不同的抗原表位和抗原結(jié)合力不同，cTnI片段具有不同的清除率和降解速度，以及使用了不同的標(biāo)準(zhǔn)品，這些因素使檢測(cè)結(jié)果間存在很大差異，據(jù)研究報(bào)道，不同方法之間檢測(cè)的差異可達(dá)100倍；因此，開展cTnI檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化研究工作是十分有必要的。然而，cTnI的來源十分有限，制約了cTnI檢測(cè)技術(shù)方

2、法的改進(jìn)和檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化研究，因此采用基因工程的方法，構(gòu)建表達(dá)載體，并大規(guī)模的表達(dá)，是解決cTnI來源有限的一種有效途徑。
　　 本研究的目的是在已構(gòu)建的人心肌肌鈣蛋白I的原核表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，優(yōu)化表達(dá)條件，提高目的蛋白在大腸桿菌中表達(dá)率，并建立純化的方法，制備抗cTnI的高親和力單克隆抗體及多克隆抗體。
　　 影響cTnI在大腸桿菌（E.coli）表達(dá)的因素包括溫度、pH、搖床轉(zhuǎn)速、IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的選擇和

3、培養(yǎng)基的組成，為全面考察各因素對(duì)cTnI蛋白表達(dá)的影響，采用單因素設(shè)計(jì)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)都不能考察各因素間的交互作用，且工作量大，因此本研究采用兩步試驗(yàn)設(shè)計(jì)，PBD（Plackett Burman Design）實(shí)驗(yàn)考察各因素間的對(duì)cTnI蛋白影響的大小，響應(yīng)曲面法（RSM）用于優(yōu)化表達(dá)條件，通過構(gòu)建回歸方程預(yù)測(cè)cTnI的表達(dá)率，并獲得最優(yōu)表達(dá)條件。該方法可以考察各因素對(duì)cTnI蛋白表達(dá)的影響，同時(shí)獲得最優(yōu)的表達(dá)條件，且減少了工作量。

4、>　　 采用硫酸銨沉淀和離子交換層析法純化cTnI蛋白，經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)目的蛋白，純度達(dá)到99％以上。以純化的cTnI蛋白為抗原，免疫BALB/c小鼠，取脾細(xì)胞同骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0細(xì)胞融合，制備單克隆抗體；以cTnI為抗原免疫新西蘭大耳白兔制備多克隆抗體，并檢測(cè)制備抗體的性質(zhì)。
　　 經(jīng)過優(yōu)化條件及純化，獲得了大量高純度的cTnI蛋白，并制備了分泌高親和力的抗cTnI的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為：C58