28960.重組人尿胰蛋白酶抑制劑發(fā)酵和純化工藝的研究及其性質(zhì)的初步鑒定

1、分類號：Q8lUDC：密級華東理工大學(xué)工程碩士學(xué)位論文重組人尿胰蛋白酶抑制劑發(fā)酵和純化工藝的研究及其性質(zhì)的初步鑒定姚美玲指導(dǎo)教師姓名：王學(xué)東副教授華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院閆慶連高級工程師山東百因制藥技術(shù)有限公司申請學(xué)位級別：碩士工程領(lǐng)域：生物工程論文定稿日期：2014528論文答辯日期：2014527學(xué)位授予單位：華東理工大學(xué)學(xué)位授予日期：答辯委員會主席：儲炬教授評閱人：馬昱澍副教授王克波高級工程師華東理工大學(xué)碩士學(xué)位論文第1頁重組人尿

2、胰蛋白酶抑制劑發(fā)酵和純化工藝的研究及其性質(zhì)的初步鑒定摘要人尿胰蛋白酶抑制劑(嘶naDrtrypsiniIlllibitor，UTI)對多種絲氨酸蛋白酶有較強(qiáng)的抑制作用，臨床上已廣泛用于急性胰腺炎、慢性復(fù)發(fā)性胰腺炎和休克的治療。隨著新的藥效不斷被挖掘，探討利用基因工程技術(shù)大規(guī)模制備重組人UT】(rhUTI)具有重要意義。本課題選擇巴斯德畢赤酵母(R砌脅矽口j幻腑)表達(dá)系統(tǒng)，成功構(gòu)建并篩選了一株能高效表達(dá)目的蛋白rh—UTI的重組畢赤酵母G

3、Sll5／pPICzⅨA唧。發(fā)酵選用鹽培養(yǎng)基FM2l(添加2mL／LPTMl)，發(fā)酵過程采取變pH變溫發(fā)酵，菌體生長階段設(shè)置pH50，溫度30。c，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)階段設(shè)置pH60，溫度250C，溶氧設(shè)定20％～30％。誘導(dǎo)120h作為發(fā)酵終點(diǎn)，收獲發(fā)酵液上清抑制活性高達(dá)62x103抑制單位(IU)／mL。所得的上清液經(jīng)過硫酸銨沉淀、2017(717)陰離子交換吸附脫色除雜和SPSepharoseFastFlow陽離子交換層析后，得到純度為

4、966％的目的產(chǎn)物，回收率387％。目的產(chǎn)物是分子量分別為245kDa和203kDa的兩個(gè)蛋白，均有胰蛋白酶抑制活性，比活達(dá)到45x103Ⅳ／mg。在一定條件下純化產(chǎn)物中分子量大的蛋白能夠降解為分子量小的蛋白。本課題還初步研究了nlUTI的組成型表達(dá)，成功構(gòu)建并篩選了一株能有效表達(dá)rhUTI的重組畢赤酵母GSll5／pGAPZⅡA一￡，，Ⅳ，利用以甘油為碳源的培養(yǎng)基發(fā)酵，最終收獲上清的活性為899102IU／mL(以2L初始反應(yīng)體積計(jì))