鹽藻DsMAPK的原核表達(dá)、反義表達(dá)和亞細(xì)胞定位分析.pdf

1、鹽生杜氏藻（Dunaliella salina，以下簡(jiǎn)稱鹽藻）無細(xì)胞壁，為天然原生質(zhì)體，由于極強(qiáng)的耐鹽能力，簡(jiǎn)單的細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及便利的培養(yǎng)條件使其成為研究植物耐鹽機(jī)制最理想的模式生物。促有絲分裂活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)屬于絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶，存在于所有真核生物中，它在植物的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)及抗逆應(yīng)答等生理過程中起重要作用。因此，深入探討鹽藻MAPK基因的

2、功能對(duì)于闡明細(xì)胞高度復(fù)雜的分子機(jī)制具有重要科學(xué)意義。
　　本論文在實(shí)驗(yàn)室已獲得DsMAPK基因的基礎(chǔ)上，開展了鹽藻DsMAPK的原核表達(dá)、反義表達(dá)和亞細(xì)胞定位分析的研究。本實(shí)驗(yàn)的研究方法與結(jié)果如下：
　　1.通過PCR技術(shù)擴(kuò)增DsMAPK基因的開放閱讀框（ORF），并將其克隆至帶有GST標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pGS-21a上，成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pGS-21a-MAPK。將原核表達(dá)載體pGS-21a-MAPK導(dǎo)入E. coli.

3、 BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后融合蛋白在E.coli. BL21(DE3)中得到成功表達(dá)。通過SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)形式，結(jié)果在上清和包涵體中均有存在。上清蛋白經(jīng)過GST-SefinoseTM Kit純化后獲得了純度較高的可溶性融合蛋白，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示該融合蛋白能被抗GST單克隆抗體特異性識(shí)別，初步證明得到了純化的GST-MAPK蛋白。
　　2.將DsMAPK基因的開放閱讀框反向插入到植

4、物表達(dá)載體35S啟動(dòng)子的下游，成功構(gòu)建了反義表達(dá)載體，采用LiAc/PEG介導(dǎo)法將其導(dǎo)入鹽藻細(xì)胞。通過氯霉素篩選得到具有相應(yīng)抗性的轉(zhuǎn)基因鹽藻，用半定量RT-PCR的方法分析高鹽脅迫不同時(shí)間下轉(zhuǎn)基因鹽藻中DsMAPK表達(dá)水平的變化情況,結(jié)果顯示鹽藻DsMAPK基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)受到明顯的抑制。
　　3.將構(gòu)建成功的亞細(xì)胞定位重組載體pMDCMGN-Cat轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性單克隆，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染洋蔥內(nèi)表