膠原蛋白亞型在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及意義.pdf

1、目前惡性腫瘤仍是威脅人類生存的天敵,到2010年,癌癥死亡率將超過(guò)心臟病,成為全球頭號(hào)殺手。而肺癌已成為全球發(fā)生率最高的惡性腫瘤之一,在北美,肺癌的死亡率居各大腫瘤之首,甚至超過(guò)乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌死亡率的總和。在我國(guó),肺癌的發(fā)病率死亡率也迅速上升。在癌癥相關(guān)的死亡病例中90％是由于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移引起的,而肺腺癌晚期時(shí)常發(fā)生胸腔轉(zhuǎn)移形成胸水。在長(zhǎng)期的臨床細(xì)胞病理論斷當(dāng)中經(jīng)過(guò)大量的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察我們發(fā)現(xiàn)在肺腺癌的一些細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中癌細(xì)

2、胞的胞漿內(nèi)有一些圍繞胞核成蔥皮狀改變的纖維樣結(jié)構(gòu),尤以惡性胸水中的腺癌細(xì)胞為甚。從肺腺癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的觀察引發(fā)了我們的一個(gè)假設(shè):肺癌胸水中的中晚期肺腺癌細(xì)胞是不是同某些發(fā)生了纖維化的器官組織一樣發(fā)生了纖維化、膠原化而分泌膠原蛋白?
　　 為驗(yàn)證這一假設(shè),我們利用不同的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)膠原蛋白(Collagen protein)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型進(jìn)行檢測(cè)。
　　 材料與方法：
　　 1、材料
　　 (1)臨床資料200

3、7年7月至2009年9月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查(Thin-layer cytology test,TCT)涂片數(shù)千例篩選出做過(guò)細(xì)胞包埋蠟塊124例。所有患者術(shù)前未經(jīng)任何治療。這些病例結(jié)合臨床病史、影像學(xué)診斷及細(xì)胞病理證實(shí)為肺腺癌的共112例,其中胸水72例,痰標(biāo)本20例,支氣管肺泡灌洗液(BALF)標(biāo)本20例；另有對(duì)照12例為良性胸腔積液。
　　 (2)細(xì)胞沉渣標(biāo)本經(jīng)診斷為肺腺癌的胸水、痰、肺泡灌洗液脫

4、落細(xì)胞離心取沉渣,將沉渣轉(zhuǎn)移至EP管,放-70℃冰箱凍存:來(lái)自于胸水增生上皮沉渣的收集同上。
　　 (3)主要試劑 羊抗人COL1A1 COL3A1多克隆抗體、鼠抗人COL2A1單克隆抗體(SantaCruze,美國(guó)),兔抗山羊、羊抗鼠二抗(北京中杉金橋),鼠抗人CK19、TTF-1、Vimentin單克隆抗體(Bio Genex,美國(guó)),S-P組化試劑盒,masson氏改良三色染料(廈門邁威生物科技有限公司)。
　　

5、2、方法
　　 (1)masson特殊染色石蠟細(xì)胞學(xué)切片常規(guī)烤片,脫蠟,水化；A試劑(蘇木素染色液)染色5分鐘,鹽酸酒精分色,水沈返藍(lán)； B試劑(masson氏改良三色染料)常溫過(guò)夜,水洗至無(wú)染料脫落； C試劑(0.2％冰醋酸溶液)洗30秒；梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片；顯微鏡下觀察。
　　 (2)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)石蠟包埋細(xì)胞學(xué)標(biāo)本4 μ m厚切片常規(guī)烤片、脫蠟、水化,采用鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶法(St

6、reptavidin-peroxidase,S-P)按說(shuō)明書(shū)行免疫組化染色。COL1A1、COL2A1、COL3A1-抗稀釋濃度均為1:50,二抗?jié)舛?:500,CK19、TTF-1、Vimentin抗體均為即用型抗體。以PBS代替-抗做陰性對(duì)照。
　　 (3)Westernblot技術(shù)總蛋白從收集的細(xì)胞沉渣標(biāo)本中提取,以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行蛋白定量,計(jì)算各樣品蛋白濃度,取等量蛋白,進(jìn)行SDS-PAGE和轉(zhuǎn)印,分別孵育-抗(C

7、OL1A1、COL2A1、COL3A11:500稀釋)4℃過(guò)夜,相應(yīng)二抗(1:5000)37℃孵育2h,ECL發(fā)光。以β-actin為內(nèi)參照。
　　 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析,膠原纖維在肺腺癌不同細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中的表達(dá)率采用卡方檢驗(yàn),Collagen protein亞型之間的相關(guān)性采用非參數(shù)Spearman等級(jí)相關(guān)分析,P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1

8、、液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查觀察到有纖維蔥皮樣結(jié)構(gòu)存在的腫瘤細(xì)胞均為肺腺癌細(xì)胞且有間質(zhì)細(xì)胞的特征 經(jīng)過(guò)TCT,我們?cè)跀?shù)千例惡性腫瘤細(xì)胞胞漿中觀察到一些圍繞胞核呈蔥皮樣改變的纖維樣結(jié)構(gòu),而在良性胸水增生的上皮細(xì)胞中始終沒(méi)發(fā)現(xiàn)這種結(jié)構(gòu)。在細(xì)胞石蠟包埋切片的HE染色中這種結(jié)構(gòu)更加凸顯的出現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中,甚至有的腫瘤細(xì)胞核已經(jīng)消失,完全被這種膠原纖維結(jié)構(gòu)取代,進(jìn)一步做了免疫細(xì)胞化學(xué)染色TTF-1、CK19和Vimentin,證實(shí)了這些腫瘤細(xì)胞均為肺腺癌

9、細(xì)胞并且具有間質(zhì)細(xì)胞的特征。
　　 2、膠原纖維在肺腺癌的不同細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中的表達(dá)情況 masson特殊染色顯示膠原纖維在胸腔積液肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)率為59.70％(43/72),在痰及支氣管肺泡灌洗液的腺癌細(xì)胞中表達(dá)率分別為20％(4/20)、30％(6/20),在良性胸腔積液增生上皮中不表達(dá)(0/12),在胸水中肺腺癌細(xì)胞的陽(yáng)性率要顯著高于在痰和肺泡灌洗液中肺腺癌細(xì)胞的陽(yáng)性率(P<0.05),陽(yáng)性表達(dá)為在腫瘤細(xì)胞胞漿或胞膜內(nèi)成

10、一種亮綠色或藍(lán)色。
　　 3、膠原蛋白亞型在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及相關(guān)性
　　 (1)膠原蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果
　　 膠原蛋白各亞型間表達(dá)關(guān)系免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示:COL1A1、COL2A1和COL3A1在肺腺癌細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為22.6％(28/124),5.6％(7/124),22.6％(28/124),陽(yáng)性表達(dá)主要定位于胞漿,而在增生的上皮細(xì)胞中不表達(dá),統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示COL1A1、COL3A1的表達(dá)

11、率要顯著高于COL2A1的表達(dá)率(P=0.024),并且我們發(fā)現(xiàn)COLA1與COL3A1的表達(dá)成正相關(guān)性(r=0.908,P=0.045)。
　　 (2)Western-blot結(jié)果
　　 Western-blot法檢測(cè)膠原蛋白亞型在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)參照DNA分子量標(biāo)準(zhǔn),肺腺癌細(xì)胞中可見(jiàn)在130KD,190KD,110KD附近有特異性條帶,對(duì)應(yīng)位置分別為COL1A1,COL2A1,COL3A1,而在良性胸水增生上皮中表