SA-hGM-CSF雙功能融合蛋白的制備及其生物學(xué)功能研究.pdf

1、研究背景:
　　 惡性腫瘤是危害人類生命的重大疾病，近幾年來(lái)發(fā)病率一直在持續(xù)上升，如何克服腫瘤這個(gè)難關(guān)成為人們研究的熱點(diǎn)。手術(shù)、放療和化療作為傳統(tǒng)的三大治療方法，雖然對(duì)腫瘤有一定的治療作用，但是仍存在很多的不足:如放療和化療缺乏腫瘤特異性，對(duì)正常組織細(xì)胞損傷大，毒副作用大，復(fù)發(fā)率高，不能從本質(zhì)上根治腫瘤等。因此，尋找高效無(wú)毒副作用，能夠誘導(dǎo)長(zhǎng)期免疫保護(hù)作用，防止術(shù)后復(fù)發(fā)的的新療法及新型藥物成為臨床腫瘤治療中迫切需要解決的問(wèn)題。<

2、br>　　 目前腫瘤治療的難點(diǎn)是腫瘤術(shù)后的高復(fù)發(fā)率，如何才能預(yù)防或降低復(fù)發(fā)率成為人們研究的重點(diǎn)。腫瘤的生物治療在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)中顯示了巨大的潛力，被認(rèn)為是繼手術(shù)、放療、化療之后，對(duì)腫瘤具有確切效果的又一治療方法。它主要包括腫瘤特異性主動(dòng)免疫治療、抗體靶向治療、細(xì)胞因子治療、過(guò)繼細(xì)胞免疫治療和基因治療，而細(xì)胞因子在腫瘤生物治療中應(yīng)用非常廣泛。
　　 細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞分泌的一大類的蛋白、多肽和糖蛋白，它能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)

3、，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的，被廣泛應(yīng)用于臨床腫瘤疾病的治療。
　　 由于全身用藥量大，會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，因此臨床上多采用局部用藥。但是因?yàn)榻M織的彌散作用，代謝較快，病灶周圍細(xì)胞因子在局部不能達(dá)到有效濃度并較長(zhǎng)時(shí)間的維持，因此限制了其抗腫瘤的效果。
　　 鏈親和素(SA)，是由Streptomyces avidinii菌分泌的的一種非糖基化的蛋白質(zhì)，每個(gè)SA分子可以結(jié)合4個(gè)生物素分子。生物素

4、又稱維生素H，細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的氨基易生物素化，而生物素化對(duì)機(jī)體和細(xì)胞無(wú)明顯毒副作用?；阪溣H和素與生物素化的分子快速且?guī)缀醪豢赡娴膹?qiáng)力結(jié)合，以及生物素較容易滲入各種生物分子的特性，我們建立了一個(gè)新的技術(shù)平臺(tái)——蛋白質(zhì)錨定技術(shù)，即將鏈親和素標(biāo)記的細(xì)胞因子錨定在已經(jīng)生物素化的腫瘤細(xì)胞表面，從而制成了腫瘤疫苗。先用生物素化試劑將生物素化學(xué)交聯(lián)到腫瘤細(xì)胞或組織表面的膜蛋白上，然后將鏈親和素標(biāo)記的目標(biāo)蛋白即雙功能分子借助鏈親和素與生物素的特異結(jié)合

5、將目標(biāo)蛋白錨定在腫瘤細(xì)胞膜或腫瘤組織表面，其中生物素化反應(yīng)對(duì)細(xì)胞、組織和機(jī)體無(wú)明顯的不良作用，這種技術(shù)可以使融合蛋白在體內(nèi)對(duì)腫瘤組織進(jìn)行快速原位修飾，迅速永久地固定在腫瘤病灶及其周圍，固定的量可以進(jìn)行精確的控制，可持續(xù)維持細(xì)胞因子在腫瘤細(xì)胞膜上及其腫瘤組織中的有效治療濃度，并避免大量細(xì)胞因子進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)引起的嚴(yán)重的毒副作用。
　　 粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)是一種造血生長(zhǎng)因子和免疫調(diào)節(jié)因子，由多種類型細(xì)胞產(chǎn)生，

6、包括巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞以及活化的CD4+、CD8+細(xì)胞。它是一種能夠強(qiáng)烈刺激巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞的增殖、分化、活化、成熟和趨化的細(xì)胞因子，還能夠增加主要組織相容性復(fù)合物、共刺激分子的表達(dá)并增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞的抗腫瘤能力。它通過(guò)促進(jìn)抗原提呈來(lái)建立固有免疫和適應(yīng)性免疫之間的聯(lián)系，進(jìn)而增強(qiáng)特異性免疫應(yīng)答。
　　 本室先前的實(shí)驗(yàn)表明:鏈親和素標(biāo)記的鼠GM-CSF融合蛋白制成的腫瘤疫苗在鼠的淺表膀胱癌以及前列腺癌動(dòng)物模

7、型中，有效緩解了細(xì)胞因子的降解，維持了細(xì)胞因子的濃度，起到了很好的抗腫瘤效應(yīng)。但是由于人和鼠具有種系差異性，因此，對(duì)人的GM-CSF需要做進(jìn)一步的研究。
　　 本文構(gòu)建了SA/hGM-CSF原核表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，對(duì)SA/hGM-CSF雙功能融合蛋白的純化與復(fù)性進(jìn)行了研究，并對(duì)其雙功能活性進(jìn)行了初步鑒定，為以后SA/hGM-CSF雙功能融合蛋白在臨床抗腫瘤的大量應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　　 研究目的:

8、　　 構(gòu)建SA/hGM-CSF重組表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)純化SA/hGM-CSF雙功能融合蛋白，并研究其生物學(xué)功能。
　　 研究方法:
　　 1.構(gòu)建SA/hGM-CSF重組表達(dá)質(zhì)粒
　　 應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增hGM-CSF目的片段，產(chǎn)物經(jīng)雙酶切并純化回收，然后與本室保存的pET24a-SA載體連接。獲得pET24a-SA-hGM-CSF及pET24a-hGM-CSF-SA原核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)菌落PCR及雙酶切初步鑒定后，送

9、公司測(cè)序以充分驗(yàn)證基因框架的正確。
　　 2.SA/hGM-CSF雙功能融合蛋白的表達(dá)純化
　　 探索出SA/hGM-CSF雙功能融合蛋白的最佳誘導(dǎo)條件（誘導(dǎo)時(shí)間，誘導(dǎo)溫度等）。大量擴(kuò)增細(xì)菌并收集菌體，通過(guò)12％SDS-PAGE凝膠來(lái)確定融合蛋白是在包涵體還是在上清中表達(dá)。在包涵體表達(dá)的蛋白純化之前需要在變性劑（如鹽酸胍，尿素等）的作用下，充分溶解。由于融合蛋白帶有His標(biāo)簽，因此利用Ni-NTA填料來(lái)純化蛋白。利用不同

10、濃度的咪唑磷酸鹽緩沖液，從低濃度到高濃度依次洗脫蛋白，收集洗脫峰，經(jīng)12％SDS-PAGE凝膠鑒定，目的蛋白在何種濃度的咪唑磷酸鹽緩沖液中被洗脫下來(lái)。
　　 3.SA/hGM-CSF雙功能融合蛋白的復(fù)性
　　 SA/hGM-CSF雙功能融合蛋白在尿素體系中采用梯度稀釋法復(fù)性，逐漸降低尿素濃度。復(fù)性過(guò)程中形成中間體和多聚體是蛋白質(zhì)復(fù)性的最大問(wèn)題所在，中間體阻礙作用大，蛋白質(zhì)正確折疊困難，復(fù)性就困難。降低蛋白質(zhì)的濃度可以減少

11、中間體的形成并且提高復(fù)性效率。在蛋白質(zhì)中加入50mmol/L的β-巰基乙醇，以充分打開(kāi)蛋白質(zhì)的二硫鍵。為了促使二硫鍵的形成，在復(fù)性液中加入了還原型谷胱甘肽及氧化型谷胱甘肽，提高蛋白的復(fù)性率。
　　 4.SA/hGM-CSF雙功能融合蛋白的進(jìn)一步純化
　　 利用DEAE-Sepharose FF對(duì)復(fù)性后SA/ hGM-CSF融合蛋白進(jìn)行離子交換層析純化，利用不同濃度的NaCl的Tris-HCl緩沖液，從低濃度到高濃度依次洗

12、脫蛋白，收集洗脫峰，經(jīng)12％SDS-PAGE凝膠鑒定，目的蛋白在何種濃度的NaCl的Tris-HCl緩沖液中被洗脫下來(lái)。
　　 5.SA/hGM-CSF雙功能融合蛋白的Western Blotting鑒定
　　 10％ SDS-PAGE電泳分離蛋白，利用半干電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5％的脫脂奶粉于37℃封閉3h后，加入1:2000封閉液稀釋的鼠抗人GM-CSF單克隆抗體4℃孵育12h，TBST洗滌3次，加入偶聯(lián)

13、辣根過(guò)氧化物酶的羊抗鼠IgG二抗（1:5000稀釋）37℃孵育1h，TBST洗滌后用ECL曝光。
　　 6.SA/hGM-CSF雙功能融合蛋白的活性鑒定
　　 hGM-CSF可以在體外促進(jìn)人紅白血病細(xì)胞的增殖，利用體外促人紅白血病細(xì)胞增殖法檢測(cè)融合蛋白的活性，并與標(biāo)準(zhǔn)品比較活性是否有差異。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的比較獲得所制備的SA/hGM-CSF雙功能融合蛋白的活性單位。
　　 7.流式細(xì)胞儀檢測(cè)SA/hGM-CSF雙功

14、能融合蛋白的錨定率
　　 生物素化腫瘤細(xì)胞，將SA/hGM-CSF融合蛋白錨定到已生物素化的腫瘤細(xì)胞表面，加入鼠抗人GM-CSF單克隆抗體（一抗），充分反應(yīng)后，加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG(二抗)，充分洗滌后，上機(jī)檢測(cè)，分析SA/hGM-CSF對(duì)腫瘤細(xì)胞的錨定修飾結(jié)果。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.成功構(gòu)建pET24a-SA-hGM-CSF及pET24a-hGM-CSF-SA重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序，結(jié)

15、果與GenBank收錄的SA和和hGM-CSF序列完全一致，基因讀碼框架正確。
　　 2.將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，經(jīng)篩選獲得表達(dá)工程菌，培養(yǎng)后在37℃，IPTG誘導(dǎo)4h，目的蛋白的表達(dá)量占總蛋白表達(dá)量的20％，主要以包涵體形式表達(dá)。包涵體首先用6mol/L鹽酸胍溶解，在鹽酸胍完全溶解后再用6mol/L尿素磷酸鹽緩沖液稀釋10倍，提高融合蛋白回收率。經(jīng)洗滌后，融合蛋白的純度達(dá)到65％，鎳金屬螯合層析后，經(jīng)12％

16、SDS-PAGE凝膠鑒定，SA-hGM-CSF及hGM-CSF-SA兩種融合蛋白分別在30mmol/L、50mmol/L咪唑濃度洗脫下來(lái)，純度達(dá)到91％。
　　 3.復(fù)性后SA/hGM-CSF雙功能融合蛋白主要以多聚體的形式存在，且復(fù)性過(guò)程中形成的沉淀較少。
　　 4.復(fù)性后的融合蛋白用DEAE-Seperose層析柱純化，分別用30mmol/L、50mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、300 mm

17、ol/L、500 mmol/L、1mmol/L NaCl洗脫液洗脫蛋白。SA/hGM-CSF雙功能融合蛋白在200 mmol/L NaCl濃度洗脫下來(lái)，純度達(dá)到96％。
　　 5.Western Blotting結(jié)果證明SA/hGM-CSF雙功能融合蛋白單體與多聚體均能與GM-CSF單克隆抗體結(jié)合，并發(fā)生顯色反應(yīng)。
　　 6.SA/hGM-CSF雙功能融合蛋白能夠促進(jìn)人紅白血病細(xì)胞增殖，呈劑量依賴關(guān)系。SA/hGM-CS

18、F雙功能融合蛋白的活性和hGM-CSF標(biāo)準(zhǔn)品無(wú)明顯差別。經(jīng)比較分析，發(fā)現(xiàn)SA-hGM-CSF和hGM-CSF-SA的生物學(xué)活性無(wú)明顯差別。
　　 7.流式細(xì)胞儀檢測(cè)SA-hGM-CSF及hGM-CSF-SA雙功能融合蛋白的腫瘤細(xì)胞錨定率，錨定率為99.94％、99.98％。
　　 研究結(jié)論:
　　 1.成功構(gòu)建了pET24a-SA-hGM-CSF及pET24a-hGM-CSF-SA重組表達(dá)質(zhì)粒。
　　 2