載脂蛋白M定點誘變及其生物學功能檢測.pdf

1、目的:對人ApoM基因定點誘變，構建ApoM野生型和突變型原核、真核表達載體，并檢測其生物學功能。
　　方法: Trizol法抽提肝L02細胞總RNA，RT-PCR擴增ApoM全長基因，將基因片斷重組到PMD18-T質粒中構建PMD18-T-ApoM重組質粒載體，轉化到大腸埃希菌 JM109后篩選陽性克隆，提取質粒酶切和測序鑒定。采用sited-directed mutagenesis試劑盒對ApoM基因進行體外定點誘變，DNA測

2、序鑒定定點誘變成功與否。用雙酶切方法分別將ApoM野生型和突變型基因定向連接到原核表達載體pGEX-KG和真核表達載體pEGFP-N3中，構建野生型和突變型原核表達質粒 pGEX-KG-ApoM和真核表達質粒 pEGFP-N3-ApoM，分別轉化到大腸埃希菌DH5α內(nèi)，提取質粒酶切鑒定和測序鑒定。將構建的原核表達質粒pGEX-KG-ApoM轉化大腸埃希菌DE3(BL21)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結果顯示，野生型原核表達質粒pGEX-

3、KG-ApoM能高效表達ApoM融合蛋白。將構建的野生型和突變型真核表達質粒pEGFP-N3-ApoM瞬時轉染入7402細胞中，利用western blot技術檢測轉染后的7402細胞ApoM蛋白表達水平，利用3H標記的膽固醇體外利用實驗、THP-1細胞參與的膽固醇流出實驗以及CuSO4參與抗氧化實驗檢測野生型和突變型ApoM蛋白生物學功能間差異。結果成功克隆 ApoM全長基因并構建野生型和突變型ApoM原核、真核表達載體。Wester

4、n blot結果顯示，野生型原核表達質粒能高效表達ApoM融合蛋白。轉染真核野生型ApoM重組質粒的7402細胞用WB檢測，ApoM蛋白表達水平增強，而轉染空載體組、空脂質體組、和突變型ApoM真核表達質粒組的ApoM蛋白表達水平均較低。在THP-1細胞參與的膽固醇流出實驗中，與空載體組、空脂質體組、和ApoM突變載體組比較，野生型載體組具有明顯的促進膽固醇從泡沫細胞中流出的作用，差異具有顯著性（P＜0.05）；ApoM突變型載體組、空

5、載體組和空脂質體組之間，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在 CuSO4參與的抗氧化實驗中，
　　結果:顯示，ApoM野生型真核表達質粒表達的蛋白與ApoM突變型真核表達質粒表達的蛋白相比，前者的抗氧化能力明顯的強于后者而突變型組，差異具有顯著性（P＜0.05）；ApoM突變型重組質粒、空載體組和空脂質體組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　結論:通過 RT-PCR、定點誘變及基因重組技術成功構建野生型和突變型重組表

6、達質粒。通過轉化實驗，野生型原核表達質粒能高效表達ApoM融合蛋白。瞬時轉染 ApoM野生型真核表達質粒后的7402細胞可以有效地高表達ApoM蛋白，而ApoM突變型真核表達質粒組的ApoM蛋白表達水平均較低。在膽固醇流出和抗氧化實驗中，野生型重組體組具有明顯的促進膽固醇從由THP-1細胞轉化的泡沫細胞中流出和抗氧化作用而ApoM突變型重組體組的這些功能明顯減弱或喪失，為進一步研究ApoM在脂質代謝、在CHD發(fā)生發(fā)展中的作用奠定了基礎。