磷酸鈣陶瓷表面微納結(jié)構(gòu)的制備及其生物學(xué)功能研究.pdf

1、磷酸鈣作為骨組織的主要無(wú)機(jī)成分，能與活體組織形成化學(xué)性鍵合，具有優(yōu)良的骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性，是目前學(xué)術(shù)界公認(rèn)的適用于臨床應(yīng)用的生物活性陶瓷材料。生物材料植入體內(nèi)后其表面與生物環(huán)境直接接觸，因此材料表面與細(xì)胞的相互作用是生物材料成功應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。越來(lái)越多的研究表明生物材料表面的微納結(jié)構(gòu)能夠有效調(diào)控細(xì)胞的粘附、伸展、增殖和分化?；诖?，本研究旨在羥基磷灰石陶瓷表面制備不同的微納結(jié)構(gòu)，研究表面微納結(jié)構(gòu)化磷酸鈣陶瓷的骨誘導(dǎo)性及其成骨作用機(jī)制

2、。
　　本文首先利用RNA-seq技術(shù)系統(tǒng)研究鈣離子對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響及作用機(jī)制;之后使用分子對(duì)接技術(shù)研究羥基磷灰石分子與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白纖粘連蛋白(FN)的相互作用機(jī)制，對(duì)羥基磷灰石陶瓷生物相容性及成骨誘導(dǎo)特性機(jī)制進(jìn)行探討;在此基礎(chǔ)上，為提高羥基磷灰石支架的生物活性特別是成骨誘導(dǎo)能力，采用水熱合成和機(jī)械處理的方法制備了具有不同表面微納結(jié)構(gòu)的羥基磷灰石陶瓷，對(duì)其進(jìn)行表征和生物學(xué)功能檢測(cè)，最后對(duì)其表面微納結(jié)構(gòu)作用機(jī)制進(jìn)行分

3、析推測(cè)。主要內(nèi)容及結(jié)果歸納如下:
　　將大鼠BMSC培養(yǎng)在10mM鈣離子DMEM培養(yǎng)基中，分別對(duì)1、4、7天后的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（以正常培養(yǎng)基做對(duì)照）。利用Tophat軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行基因組比對(duì)，Cufflinks軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本組裝以及差異表達(dá)基因搜索，最后使用網(wǎng)絡(luò)分析工具DAVID進(jìn)行差異表達(dá)基因的歸類、注釋及功能分析。結(jié)果表明，鈣離子促進(jìn)了BMP2基因的表達(dá)，同時(shí)抑制了BMP通道阻抑蛋白BMPer的表達(dá);對(duì)于ERRR，WN

4、T和TGF-β等其它成骨誘導(dǎo)相關(guān)信號(hào)通道分析表明，信號(hào)通道激活蛋白表達(dá)減少而阻抑蛋白表達(dá)增多。
　　其次，利用Auto DOCK軟件分析羥基磷灰石分子與FN部分片段(FN-Ⅲ7-10)之間的相互作用。結(jié)果表明羥基磷灰石分子與FN-Ⅲ7-10的結(jié)合位點(diǎn)主要位于RGD區(qū)域所在的片段，并且此片段對(duì)于相鄰片段與羥基磷灰石分子的結(jié)合有促進(jìn)作用。羥基磷灰石分子與FN-Ⅲ7-10的結(jié)合位點(diǎn)主要位于RGD肽段的一側(cè)，不會(huì)影響FN-Ⅲ7-10與細(xì)胞

5、表面受體的結(jié)合;羥基磷灰石分子與FN-Ⅲ7-10的結(jié)合位點(diǎn)處精氨酸出現(xiàn)的頻率高。這從理論上闡述了羥基磷灰石良好生物相容性的分子機(jī)制。
　　接著，使用鈣磷鹽將羥基磷灰石陶瓷支架進(jìn)行浸漬處理，增加表面鈣磷成核位點(diǎn)，加入肌醇六磷酸(IP6)，150℃反應(yīng)3h制備不同微納結(jié)構(gòu)磷酸鈣涂層。結(jié)果表明IP6調(diào)控磷酸鈣在支架表面沉積，形成長(zhǎng)橢球狀顆粒組成微納結(jié)構(gòu);如水熱反應(yīng)中無(wú)IP6，則支架表面形成六棱柱狀微納結(jié)構(gòu)，涂層厚度小。鈣離子釋放實(shí)驗(yàn)表明

6、，橢球狀磷酸鈣涂層支架鈣離子釋放速度快，釋放量多;體外實(shí)驗(yàn)表明，不同表面微納結(jié)構(gòu)支架都具有良好的生物相容性，橢球狀磷酸鈣涂層更加有利于間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的成骨分化，其中BMP2和YAP/TAZ扮演著重要的角色。
　　最后利用打磨拋光方法在三種不同工藝制備的羥基磷灰石陶瓷表面制備微孔結(jié)構(gòu)，通過(guò)掃描電子顯微鏡(SEM)，X射線衍射儀(XRD)，輪廓儀等對(duì)表面微孔進(jìn)行表征。結(jié)果表明，經(jīng)機(jī)械研磨后，致密羥基磷灰石陶瓷表面形成大量微納米

7、級(jí)凹孔，平均內(nèi)徑分別是0.8577μm和1.1406μm。FN蛋白吸附實(shí)驗(yàn)表明羥基磷灰石陶瓷表面微孔結(jié)構(gòu)影響了蛋白吸附。此外，分別在細(xì)胞與分子水平上通過(guò)免疫熒光染色、堿性磷酸酶(ALP)活性檢測(cè)、以及成骨相關(guān)基因的RT-PCR檢測(cè)表明，材料表面微孔結(jié)構(gòu)化羥基磷灰石陶瓷細(xì)胞粘附及增殖無(wú)顯著差異，細(xì)胞形貌具有明顯不同，ALP活性有少量的差別;成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)也有較小的差異。
　　綜上所述，磷酸鈣陶瓷表面的微納結(jié)構(gòu)通過(guò)調(diào)控蛋白的吸