類骨結(jié)構(gòu)膠原纖維基多孔磷酸三鈣-膠原復(fù)合材料的制備及其生物學(xué)評價(jià).pdf

1、骨缺損、骨不連的修復(fù)，一直是骨科領(lǐng)域的棘手問題，人們采用許多修復(fù)辦法如自體骨移植、同種異體骨移植、異種骨移植、金屬材料、陶瓷及人工合成的高分子材料等來修復(fù)骨缺損，但是它們都有各自的缺陷。如供體來源有限、免疫排異反應(yīng)、難以降解、有毒及其它副反應(yīng)。近年來設(shè)計(jì)仿生骨基質(zhì)材料，為解決骨缺損及骨不連修復(fù)提供了全新的修復(fù)辦法，并己滲入到骨科各個(gè)領(lǐng)域，成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。 仿生骨基質(zhì)材料就是設(shè)計(jì)一種具有和天然骨基質(zhì)類似的結(jié)構(gòu)(結(jié)構(gòu)仿生)

2、和功能(功能仿生)的骨基質(zhì)材料。這種仿生骨基質(zhì)材料應(yīng)在體內(nèi)除了應(yīng)有良好的生物活性和降解性，具有促進(jìn)或加速骨組織修復(fù)的效能是當(dāng)前生物材料研究的重點(diǎn)。 本文基于自然骨的組元和微觀結(jié)構(gòu)，通過微觀結(jié)構(gòu)仿生與化學(xué)組元優(yōu)化相結(jié)合，將納米磷酸三鈣(TCP)顆粒與骨膠原微纖維復(fù)合成為類骨結(jié)構(gòu)膠原纖維，從而可有效地利用TCP良好的生物降解特性、形貌變化特性、載體功能和膠原良好的細(xì)胞/組織相容性以及兩者的協(xié)同效應(yīng)，期望構(gòu)造出一種具有獨(dú)特微/納結(jié)構(gòu)的

3、新型骨修復(fù)/再生材料，并通過體內(nèi)、外系列實(shí)驗(yàn)研究觀察其理化性能、生物相容性及其誘導(dǎo)、傳導(dǎo)成骨的能力，為骨組織高效重建創(chuàng)建良好的的初始平臺(tái)。 為此，本論文首先開展對復(fù)合材料的制備及其理化性能的系統(tǒng)研究和表征，然后進(jìn)行了對類骨結(jié)構(gòu)膠原纖維基復(fù)合材料的體外細(xì)胞相容性和生物活性研究，最后開展了類骨結(jié)構(gòu)膠原纖維基復(fù)合材料對兔股骨骨缺損修復(fù)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，初步評價(jià)了它的骨修復(fù)能力。 主要的研究內(nèi)容如下： (1)經(jīng)過酸性介質(zhì)對

4、膠原處理形成膠原微纖維，分別加入納米TCP顆粒，在濕化學(xué)條件下制成類骨結(jié)構(gòu)膠原纖維基多孔B-TCP/Col復(fù)合材料，應(yīng)用掃描電鏡觀察復(fù)合材料的顯微形貌、孔徑，測量孔隙率，并浸泡于PBS緩沖液中觀察B-TCP/Col復(fù)合材料的形貌變化。結(jié)果顯示：酸性條件下，類骨結(jié)構(gòu)膠原纖維構(gòu)成的孔壁成網(wǎng)狀；最佳酸性條件為pH=2；復(fù)合材料的孔徑在100μm左右，孔隙率為90％以上。經(jīng)過體外緩沖溶液的浸泡，復(fù)合材料表面行成花瓣簇狀形狀的HA，形成有利于成骨

5、細(xì)胞生長的表面結(jié)構(gòu)。 (2)采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，把成骨樣細(xì)胞MG63和類骨結(jié)構(gòu)膠原纖維基多孔B-TCP/Col復(fù)合材料復(fù)合培養(yǎng)，以TCP和MG63分別做陽性和陰性對照，用MTT法檢測細(xì)胞的粘附和增殖變化：ALP活性測定觀察材料對細(xì)胞分化的影響；掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞在材料中的生長和形態(tài)改變；逆轉(zhuǎn)錄．聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和半定量分析檢測材料對細(xì)胞內(nèi)骨特異基因表達(dá)的影響以及利用流式細(xì)胞儀(FCM)觀察分析復(fù)合

6、材料對細(xì)胞周期的影響。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)： ①細(xì)胞在種植到材料表面后隨時(shí)間延長而黏附的細(xì)胞數(shù)量增加，納米β-TCP/Col組高于單純TCP組(p<0.05)，而和空白對照組差別不顯著(p>0.05)。 ②細(xì)胞接種5天時(shí)，納米相TCP/Col表面的細(xì)胞增殖數(shù)明顯高于單純TcP組(p<0.05)，而和空白對照組無明顯差異(p>0.05)。 ③從復(fù)合培養(yǎng)的第5天起，納米相TCP/Col組細(xì)胞分泌的ALP開始增加明顯，且

7、高于單純TCP組，與空白對照組的增加無明顯差異。 ④形態(tài)學(xué)上SEM可以看到復(fù)合材料表面細(xì)胞呈扁平梭形，分布均勻、延展性好，隨著時(shí)間延長并可見到細(xì)胞基質(zhì)分泌沉積；激光共聚焦顯微鏡顯示細(xì)胞核分裂活躍。 ⑤RT-PCR及半定量分析證實(shí)，TCP/Col與成骨細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)后，成骨樣細(xì)胞內(nèi)骨鈣素和I型膠原的表達(dá)量明顯高于對照組(p<0.05)。 ⑥細(xì)胞周期分析顯示，TCP/Col提高了MG63細(xì)胞的細(xì)胞周期的S期細(xì)胞數(shù)百分比

8、，由正常的35.618％增加到了59.480％，表明增加了DNA的合成。 (3)選用健康新西蘭大白兔24只48側(cè)股骨髁做成圓柱狀骨缺損模型，將TCP/Col復(fù)合材料植入骨缺損處，設(shè)不植入任何材料的骨缺損做空白對照。術(shù)后2、4、8、12周進(jìn)行X線攝片檢查，并取材做組織形態(tài)學(xué)、掃描電鏡觀察；并對股骨缺損局部骨密度進(jìn)行測定，初步評價(jià)復(fù)合材料的骨修復(fù)能力。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)： ①X線顯示，2周時(shí)骨缺損區(qū)密度逐漸增高，材料未發(fā)生大

9、量降解；4周時(shí)植入?yún)^(qū)域材料的輪廓變得模糊，植入?yún)^(qū)域的亮度開始下降，材料的密度開始逐漸降低；8周時(shí)缺損區(qū)邊緣模糊，密度繼續(xù)降低，植入體與宿主骨部分橋接，骨透射性進(jìn)一步降低，骨組織向材料內(nèi)部延伸，材料大部分被降解替代；12周時(shí)，材料形狀消失，密度與正常組織大致相當(dāng)，材料與骨組織融合在一起，骨缺損基本被修復(fù)。而12周時(shí)，對照組缺損區(qū)有少量的骨癡和硬化，骨修復(fù)征象不明顯。 ②組織切片可見，材料植入2周時(shí)，缺損內(nèi)見大量成骨細(xì)胞、纖維組織和

10、新生微血管長入；4周時(shí)，植入?yún)^(qū)有大量小梁骨組織及類骨質(zhì)形成；8周時(shí)，支架材料大部分吸收，類骨質(zhì)不斷增多，形成大量骨島；12周時(shí)，新骨大面積生成，新骨組織漸連接成片，可見哈佛氏系統(tǒng)：對照組在12周時(shí)，圓形缺損形態(tài)完整，未見到有明顯的骨組織形成。 ③骨密度檢測發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組在4周以后骨礦化的速度較對照組明顯增高，在12周時(shí)，接近正常小梁骨的密度(p<0.05)。經(jīng)過上述研究，仿生TCP/Col復(fù)合材料具有和骨組織相類似的三維多孔結(jié)構(gòu)，